cap. 9. Biología de las Células NK o Natural Killers

Autor:
Ricardo Antonio Giuliani

Resúmen
Las células NK constituyen la primera barrera de defensa contra gérmenes intracelulares.
No requieren presentación antigénica ni contacto previo con patógenos. Ejercen
citotoxicidad directa mediate liberación de Perforina y Granzima y se identifican
por la expresión constitutiva de CD56 y receptores NKp30, NKp44 y NKp46. La
presencia facultativa de CD16, CD69 y/o IL2R, no confirma el carácter NK pero
contribuye a definir su perfil. La discriminación entre células normales, tumorales o
“distresadas” depende de la interacción KIR/MHC-I. La pérdida de moléculas de
MHC-I desactiva las señales represoras KIR-dependientes. El stress promueve la
expresión de MHC-I “like” (MICA y MICB). Estas moléculas liberan citotoxicidad
NK por interacción con receptores NKp3044/46, KIR-DS o NKG2D/NKG2D.

Desarrollo
Las Células Natural Killers (NK) tienen origen en Médula Osea, integran el sistema inmune
innato y reaccionan contra células transformadas por stress, infección o neoplasia.
Se les llama Asesinas Naturales o Natural Killers por su aptitud para destruir
células tumorales In Vivo o in Vitro sin previa sensibilización (1,2) y constituyen
la primera línea de defensa contra infecciones virales (3,4,5).
Los precursores de células T tardan 5 a 7 días en el proceso de activación, proliferación
y diferenciación a Células CD8+ maduras para la función citotóxica.
Por eso, durante la primera semana de una infección, las células NK constituyen
la única herramienta disponible para el control de la replicación viral.
Debe remarcarse que Natural Killers, a diferencia de las Células T CD8+, no
requieren presentación antigénica para ejercer su función citotóxica.
Sus blancos son destruídos por efecto citotóxico directo y secreción de citokinas
como IFNγ, TNFα y GMcsf (6,7,8).
Tienen aspecto de Linfocitos Grandes Granulares, expresan CD56 y exhiben
casi con exclusividad receptores “naturales” de citotoxicidad (NCRs) NKp30,
NKp44 y NKp46 (9).
Las NKs representan entre 5% y 15% de las células mononucleares circulantes
y ocupan 5% a 10% de la celularidad del nódulo linfático.
Toda célula NK exhibe alta concentración de CD56 en su superficie, por eso
esta proteína adhesiva fue incorporada como marcador NK.
Sin embargo CD56 también puede encontrarse en tejido nervioso y diversos
linajes mieloides y linfoides.
Los Receptores Naturales de Citotoxicidad o NCRs (NKp44, NKp46 y
NKp30) son casi exclusivos de NKs, por eso califican como marcadores más específicos.
Sin embargo los Linfocitos T de Cordón Umbilical estimulados con IL-15
también pueden expresar NCRs (10).
Por consiguiente la identificación de NKs seguirá dependiendo de un concierto de
aspectos morfológicos e inmunohistoquímicos y no de la positividad de un marcador
singular.
Podremos entonces confirmar la condición NK cuando un linfocito grande granular
marque CD56+ y NCR+, eventualmente asociados a CD16+(FcγRIII), CD69+ o
IL-2R, acorde con los requerimientos funcionales de cada etapa evolutiva (10-13).
La asociación de CD56 con otros marcadores permite identificar subgrupos
de células NK. Por ejemplo CD56+débil con CD16+ (FcγRIII) fuerte indica NK
madura (90%) y CD56+brillante con IL-2R+ y baja expresión de CD16, denota
alto nivel proliferativo y baja citotoxicidad (10%) (12,14,15).
Desde el punto de vista morfológico y funcional las Células NK se parecen
bastante a Linfocitos T Citotóxicos (CTL): ambos tipos celulares destruyen sus
blancos mediante liberación de Perforina y Granzyma.
La Perforina forma polímeros tubulares en la membrana de manera similar al
componente 9 del complemento (16).
Estas proteínas tienen un dominio común llamado MACPF por Membrane
Attack Complex (MAC) y Perforin (PF).
En definitiva Perforina es un instrumento Citotóxico que se presenta tanto en fase líquida
(complemento) como empaquetada en gránulos de células T CD8+, NK o NKT.
La toxicidad por Perforina puede desatarse por activación de la casacada del
complemento, Citotoxicidad Celular Dependiente de Anticuerpos (ADCC), activación
de Célula T Citotóxica (CTL), NK o NKT. En todas estas situaciones la
reacción de citotoxicidad está controlada por sistemas moduladores: en el caso del
complemento por CD55 y CD59 (entre otros), en CTLs por CTLA4 y en NKs
por receptores inhibidores KIR (17,18,19).
La Perforina forma complejo con Granzyme B y una glucopectina, dicho complejo
reacciona con un receptor manosa-6-fosfato sobre la superficie de la célula
atacada y es envuelto e internalizado como vesícula endocítica. La perforina forma
polímeros tubulares en la membrana vesicular y habilita el acceso de Granzyme al
citosol, luego esta enzima activa la cascada de apoptosis.
GZMB es el gen de la serinoproteasa Granzyme 2 o serinoesterasa asociada a
linfocitos T citotóxicos y Células Natural Killers (20,21).
La citotoxicidad mediada por complejo Perforina/Granzyma atrapa virus en
células apoptoicas e impide su diseminación.
Por eso los pacientes que carecen de NKs suelen verse afectados reiteradamente
por formas severas de sarampión, citomegalovirus, neumonitis virales y herpes
simple (22,23).
Diversos estudios experimentales en ratas pusieron en evidencia la actividad
tumoricida de las Células Natural Killers (NKs), por eso siempre fue de interés
oncológico entender la fisiología de estas células (24,25,26).
Otra característica común entre NKs y CTLs es la expresión de CD8 en la
membrana de algunas células NK.
El heterodímero CD8α/CD8β es imprescindible para consolidar la reacción
entre el receptor T (TCR) y el complejo MHC-I/péptido antigénico (Ag).
Dicha reacción depende básicamente de la afinidad entre CD8β y el dominio α3
de MHC-I. (Ver Biología de Célula T)
El 35% de las células NK CD56+débiles expresa homodímeros CD8α/CD8α
pero no exhibe CD8β, por consiguiente estas moléculas carecen de afinidad por
α3 de MHC-I. Es de suponer entonces que en NKs el homodímero CD8α/CD8α
desempeñe tareas importantes aunque independientes de α3 MHC-I (27,28).
Además de toxicidad directa sobre blancos celulares cercanos las NKs ejercen
efectos a distancia mediante liberación de IFN-γ, TNF-α y GM-csf.
La capacidad de una célula NK para segregar dichas citokinas refleja en cierta
medida su estadio madurativo y funcional (29).
Esta fig. destaca que la reacción citotóxica NK ocurre por contacto con Células desprovistas de moléculas MHC-I.

Receptores NK
En 1986 se vio que la intensidad del efecto citotóxico NK guardaba relación inversa
con la concentración de moléculas tipo I en membranas de células tumorales.
Dicha observación seminal dio orígen a la hipótesis de la “pérdida de lo propio”
como factor desencadenante de citotoxicidad NK.
Desde entonces diversos estudios confirmaron que las moléculas tipo I de
MHC (MHC-I) inhiben la citotoxicidad de células NK (30).
La actividad de las NKs está finamente regulada por receptores agonistas y antagonistas.
La retención o liberación de citotoxicidad resulta del balance negativo
o positivo entre dichas fuerzas.
Las células NK deben ser tolerantes con células “propias normales” e intolerantes
con células transformadas por stress, infección o procesos oncológicos.
Dicha tolerancia depende del balance entre receptores ligantes de moléculas
clásicas tipo I de MHC (MHC-I) (31,32) y receptores ligantes de moléculas
“similares” a MHC-I (MHC-I “like”).
La mayoría de los receptores de inhibición ligan moléculas clásicas MHC-I y
la mayoría de los activadores moléculas MHC-I like o no clásicas.
Las proteínas MHC-I “like” son “inducibles” por stress, infección o mecanismos
oncogénicos, no se expresan en células normales, no forman complejo con
Beta 2 Micoroglobulina (β2M) y no desempeñan tareas de presentación antigénica,
función que es exclusiva de MHC-I clásicas.
Dentro de la categoría MHC-I/like están incluidas MICA, MICB, proteína
tempranamente inducible por Acido Retinoico (RAE1), moléculas H60
del complejo menor de histocompatibilidad y CMV UL-binding proteins
(ULBP) (33-37).
Resumiendo, al grupo MHC-I y MHC-I/like pertencen los antígenos HLAA,
HLA-B, HLA-Cw, HLA-E, MICA, MICB, ULBP, RAE-1, H60.
Mediante estudios cristalográficos pudo determinarse que los receptores similares
a inmunoglobulinas (KIR) forman sinapsis inmune con el dominio α1 de
moléculas clase I de MHC. Los receptores KIR no reconocen alelos individuales
sino epitopes compartidos por grupos de moléculas MHC-I (38-40).
Los péptidos encastrados en el circulo presentador de MHC-I no interactúan
con receptores de inhibición (KIR) (41).
Ergo, el principal blanco de ataque de Natural Killers son células que hayan
perdido la expresión de moléculas MHC-I por infección viral, transformación maliga
o senescencia o expresen moléculas MHC-I/like (30,42).
No obstante, un sistema adicional a moléculas clásicas y no clásicas de MHC-I
parece contribuir al sostenimiento de la tolerancia NK hacia tejidos propios.
En animales con deleción de Beta 2 Microglobula (-/-) fue posible evidenciar
la existencia de un sistema de tolerancia NK independiente de MHC-I. Las moléculas
2B4 (CD244) y CD48 inhiben la actividad citotóxica de las Células NK de
manera no redundante respecto de MHC-I (32,43).
En una misma célula NK suelen coexistir receptores de activación e inhibición.
La liberación o no de actividad citotóxica NK dependerá de la concentración de
moléculas MHC-I o eventual expresión de MHC-I/Like (44,45).
El rol dominante de las moléculas de inhibición explica que la reactividad
citotóxica de Célula NK esté circunscripta a células transformadas por malignidad,
senectud o invasión microbiana, por débil expresión de moléculas MHC-I o sobre
expresión de MHC-I “like” (42).
La única excepción es el caso de receptores killer símil lectinas como NKG2,
que reaccionan con ligantes MICA, MICB, RAE-1 o H60, liberando señales de
activación que desplazan a las señales de inhibición (35-37).
De todas maneras, cabe señalar que las señales de estimulación de NKG2 no
son totalmente refractarias a las señales de inhibición (46).
Cada célula NK expresa una singular combinación de receptores inhibidores
y activadores. En su desarrollo estas células inician la expresión de receptores de
inhibición de manera secuencial, acumulativa y estocástica. Sobre dicho proceso
se superponen múltiples mecanismos educativos que contribuyen al balance entre
activadores e inhibidores en cada célula NK.
Dichos mecanismos aseguran que la población NK pueda ejercer tolerancia
hacia “lo propio” y agresividad discriminativa ante lo extraño, transformado o infectado.
Algo similar ocurre en una fracción de CTLs (CD8+) memoria y otros
subgrupos de células T, que expresan también receptores inhibidores de manera
variable y superpuesta.
Todo parece indicar que en cada célula citotóxica el equilibrio entre receptores
de inhibición y activación estaría condicionado por encuentros previos
con patógenos (47,48,49).

En Células NK se reconocen cinco familias de receptores estructuralmente diferentes:
- Moléculas Killer adornadas con dominios similares a inmuno globulinas o Killer Immunglobulin like Receptors (KIR).
- Receptores Leucocitarios similares a Inmunoglobulinas (LIR) o transcripto similar a Ig (ILT).
- Lectinas tipo C codificadas en el complejo genético NK o Natural Killers Complex (NKC).
- Receptores naturales de citotoxicidad o Natural Cytotoxic Receptors (NCR).
- Receptores de fracción Fc de Inmunoglobulinas FcγIIIA (CD16a) (50).

Dominios ITAM e ITIM
Entre los receptores humanos KIR y CD94-NKG2 predominan inhibidores sobre activadores
y esto depende básicamente de la disponibilidad de dominios ITIM o ITAM
en sus proyecciones intracelulares o moléculas citosólicas asociadas (51,52,53).
ITIM: Immunoreceptor Tyrosine-based Inhibitory Motif o Motivos Inmunoreceptores
de Inhibición basados en Tirosina.
ITAM: Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif o Motivos Inmunoreceptores
de Activación basados en Tirosina (51).
Sobre estos dominios hemos escrito en señalizaciones activadas por TCR/MHC/Ag:
ver Célula T y Señalizaciones.
Brevemente: la fosforilación de tirosinas en ITAM promueve ensambles de activación
y en ITIM ensambles de inhibición.

Receptores con dominios inmunoglobulinas (KIR)
Los receptores Killer Inmunoglobulin-like (KIR) son glicoproteínas transmembrana
tipo I que se expresan característicamente en células Natural Killers (NK).
Importante: Las proteínas de membrana difieren por la posición de su terminal
extracelular: Amino (tipo I) o Carboxilo (tipo II).
Un 2% de células T puede también exhibir proteínas KIR en su superficie,
particularmente aquellas con fenotipo T CD8+ memoria (54,55).
Los genes KIR son homólogos entre sí, muy polimórficos y se agrupan en el
locus LRC 19q13.4 de 1 Mb (Megabase) de extensión. LRC significa complejo de
receptores leucocitarios (56).
A pesar de no sufrir recombinación somática, como ocurre con los receptores
antigénicos de células T (TCR) y B (BCR, los haplotipos KIR exhiben variable
cantidad de genes y diverso nivel de polimorfismo (alelos) (57,58).
Hasta ahora han sido descritas más de 100 variantes (alelos) de genes KIR,
por consiguiente la probabilidad de encontrar dos individuos con igual genotipo
KIR es <0.01 (59).
Es más, en un mismo individuo diferentes clones de células NK pueden llegar
a expresar diferentes subgrupos de repertorio KIR (60,61).
Dentro del locus LRC se agrupan cinco familias de genes y estas pueden identificarse
por análisis filogenético, número de dominios Inmunoglobulina (Ig) extracelulares
y longitud de sus colas citoplasmáticas.
En humanos hay 14 versiones KIR, ocho de cola larga (inhibidores) y seis de
cola corta (activadores).
Las proteínas KIR se clasifican acorde con el número de Dominios Inmunoglobulina
extracelulares (2D, 3D) y la dimensión de su proyección intracelular, que puede
ser Larga (L) o Corta (S).
Los KIR de cola larga pueden alojar uno o varios ITIM, que son dominios
organizadores de “signalosomas” de inhibición (ver Célula T).
La potencia inhibitoria de un KIR dependerá de la cantidad de ITIMs disponibles
en su cola citoplasmática.
Los KIR de cola corta carecen de ITIMs y están asociados a moléculas portadoras
de ITAMs, por consiguiente promueven señales de activación.
Dichas características estructurales se registran con siglas tomadas del inglés:
KIR por Killer Ig like Receptors; 2D o 3D por 2 o 3 Dominios Inmunoglobulinas
en su proyección extracelular; S o L por las dimensiones de su cola intracelular,
S por Short (cola corta) o L por Long (larga) y finalmente un número que indica
el gen correspondiente.
Por ejemplo: KIR2DL1 significa receptor killer adornado con dos motivos símil
inmunoglobulina en su proyección intracelular, cola intracitoplasmática larga,
codificado por gen 1; KIR3DS significa KIR de tres dominios Ig extracelulares y
corta proyección intracelular.
La cantidad de genes y alelos KIR en el locus LRC varía entre los diversos
haplotipos, pero algunos se repiten en todos ellos, como ocurre con los genes KIR-
3DL3, KIR3DP1, KIR3DL4 y KIR3DL2.
Los KIR de inhibición exhiben largas proyecciones intracelulares, con espacio
para alojar dos o tres motivos ITIM y los KIR de activación colas muy cortas,
carentes de dominios ITIM.
Los KIR de cola corta transmiten señales de activación mediante adaptadores
CD3ζ, FcεRIγ, DAP12 o DAP10, ligados a un residuo electronegativo de su región
transmembrana.
Los motivos ITAM de estos adaptadores, fosforilados por tirosin kinasas SRC,
reclutan ensambles agonistas de señalización.
Las moléculas CD3ζ, FcεRIγ, DAP12 y DAP10 son similares entre sí, particularmente
DAP10 y DAP12, pero difieren en la manera específica de conectarse
con receptores NK.
La activación de cualquiera de estas moléculas suele extenderse al resto de ellas, sin
embargo este sinergismo ocurre con mayor frecuencia entre DAP12 y DAP10 (62).
El complejo patrón de repertorio KIR en una célula NK singular depende de
mecanismos estocásticos y no estocásticos de expresión genética (63).
Para mantener una expresión clonal restringida de genes y alelos KIR fuertemente
homólogos, la célula NK recurre a metilación de DNA (64).
La expresión de KIRs está regulada genéticamente y no parece tener relación con el haplotipo MHC (65,66).
Las diversas duplas KIR-HLA ejercen variable nivel de potencia en sus efectos
de inhibición o activación.
El mantenimiento de un balance entre señales inhibidoras y activadoras tiene
importantes implicancias fisiológicas.
Dado que tienen capacidad citotóxica, las células NK constituyen una importante
barrera contra infecciones virales y transformación maligna.
Ergo, un exceso en señales inhibitorias podría interferir en su rol defensivo y un exceso
de actividad citotóxica podría favorecer el desarrollo de fenómenos autoreactivos (67).
A pesar su alto grado de homología los genes KIR codifican proteínas con
diverso patrón de reconocimiento de alelos HLA-I.
Los receptores KIR reconocen como ligantes moléculas HLA-A, HLA-Bw,
HLA-Cw, HLA-G, todas moléculas tipo I de MHC.
Esto da lugar a diversas combinaciones KIR-HLA-I y estas duplas interactivas
emiten señales de intensidad variable con efectos NK agonistas o antagonistas.
Cada haplotipo KIR difiere en cantidad de genes y versiones de cada uno de
ellos (alelos), por eso se dice que el locus LRC es “muy polimórfico”.
Por otra parte, dicho polimorfismo KIR guarda paralelismo con la variabilidad que
exhibe el locus MHC. Todo esto amplifica las posibilidades que tiene el Sistema Inmune
para adaptarse a los cambiantes y dinámicos desafíos del medio ambiente (68).
La susceptibilidad de un individuo frente a determinadas infecciones o
enfermedades autoinmunes se asocia frecuentemente con determinado tipo de
combinación KIR/HLA. Dicha susceptibilidad o resistencia estaría “escrita” en
la combinación de haplotipos KIR/HLA que cada individuo hereda.
Esto se ve reflejado paradigmáticamente en las combinaciones KIR/HLA que
se asocian al riesgo de desarrollar neoplasia cervical.
De hecho, las pacientes que exhiben KIR3DS1 (activador) tienen mayor riesgo
de desarrollar este tipo de cancer, particularmente aquellas que carecen de combinaciones
KIR/HLA de tipo inhibidor (protectoras) (69).
El tipo y número de receptores NKC y KIR que expresa cada célula NK, resulta
de la expresión de complejos poligénicos y polimórficos (70,71,41,72).
En suma, los receptores KIR de cola larga provocan inhibición y los de cola
corta activación.
La reacción entre un KIR inibidor y su ligante MHC-I (clásico) induce fosforilación
de tirosina en ITIMs. En esto intervienen tirosin kinasas de familia SRC.
Los ITIM reclutan y activan tirosin fosfatasas SHP1 y SHP2 portadoras de
motivos SH2 y también inositol polifosfato fosfatasas SHIP1 (73,74).
Cada versión de receptor KIR reconoce un ligante MHC-I específico.
En humanos las moléculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad
(MHC) se conocen como “Human Leukocyte Antigens” (HLA).
Los HLA tipo A, B y C corresponden a moléculas MHC de tipo I y los HLA
DQ, DR y DS a moléculas MHC de tipo II.
Es particularmente importante remarcar que estas moléculas tienen la doble
misión de presentar antígenos a receptores de Células T y modular células NKs.
Las moléculas MHC-I utilizan el surco α2/α3 para reaccionar con células T
(TCR) y los dominios α1 y α3 para modular la actividad de células NK.
Sobre moléculas MHC y su expresión en humanos (HLA) recomendamos el
capítulo específico.
Recordemos que en humanos la codificación de moléculas MHC-I está a cargo
de tres genes diferentes: HLA-A, HLA-B y HLA-C. Los tres genes se expresan
por igual y exhiben fuerte polimorfismo (múltiples alelos). Por eso es difícil
encontrar dos individuos con un panel similar de antígenos HLA.
Los KIR inhibidores tienen particular afinidad por la versión HLA-C de
MHC-I. Los KIR activadores también reaccionan con HLA-C pero con menor
intensidad (57,75,76,85).
Los alelos HLA-C se dividen en grupos 1 y 2 acorde con la presencia de Lisina
o Asparagina en posición 80 del dominio α1 (77).
Los dos grupos HLA-C actúan como ligantes de diferentes KIR y la especificidad
está determinada por el cambio de un Amino Acido (AA) singular en
posición AA 44 del dominio KIR 2D.
Las moléculas HLA-C modulan la función de células NK mediante interacción
con KIRs Inhibidores.
La herencia de diferentes combinaciones de genes KIR y HLA influye en la
mayor tendencia a contraer ciertas enfermedades. Por ejemplo, en la susceptibilidad
a la artritis psoriática influyen determinados genes de receptores de activación
en ausencia de específicos alelos HLA-C (67,78,79,80).
En definitiva la misma molécula modula reacciones citotóxicas en el contexto
de inmunidad adquirida o innata.
El dominio α3 de MHC-I es muy polimórfico y cada individuo expone un
panel específico de “anti(cuerpo)-gen(generador)os” α3 de selectiva afinidad por
receptores NK específicos.
El extenso panel de Antígenos Leucocitarios Humanos o HLA-I refleja particularmente,
la diversidad en secuencias de AA que se registra a nivel del dominio
α3 de MHC-I.
El cambio de un solo AA (SNP) genera un alelo HLA-I específico y lo mismo
ocurre en HLA-II, pero con menor grado de variablidad.
Un mismo individuo puede presentar diversos “modelos” o “alelos” de moléculas
de MHC-I y cada uno de ellos suele tener afinidad por un KIR específico.
Obviamente, cada alelo de MHC-I humano inyectado en un conejo genera un anticuerpo específico. Así pudieron construirse paneles de anticuerpos para identificación serológica de alelos HLA-I y HLA-II humanos. Recientemente este tipo de análisis fue reemplazado por estudios más específicos (PCR) (81).
El sitema HLA fue puesto en evidencia con los primeros transplantes de
tejido o médula ósea realizados entre individuos de una misma especie. Dichos
transplantes inducen la generación de anticuerpos reactivos contra diversos
alelos de moléculas MHC.
Tanto el rechazo de injerto como las reacciones injerto contra huésped, desencadenan
respuesta humoral y citotóxica NK y CTL ante “lo no propio” (82).
Los genes del sistema HLA están ubicados en un superlocus del cromosoma
6 y codifican moléculas presentadoras de antígenos.
Ese mismo locus aloja moléculas de estructura muy parecida a las MHC-I, que
carecen de surco presentador de antígeno, pero sirven para señalizar concentración de
hierro sérico (HFe) o ligar receptores killer de activación (MICA, MICB) (83).
Los antígenos HLA-I se agrupan en clases A, B y C y corresponden a moléculas
especializadas en presentación de fragmentos de proteínas endógenas digeridas
en proteosomas.
Los antígenos HLA-II se agrupan en clases DR, DP y DQ y corresponden a moléculas
especializadas en presentación de antígenos exógenos digeridos en lisosomas.
Es importante destacar que en esto también hay excepciones, porque en determinadas
circunstancias las moléculas HLA-II pueden también presentar moléculas
endógenas digeridas en proteosomas.
Ambos tipos de moléculas activan células T cuando presentan antígenos extraños
acompañados de señales de peligro. HLA-I reacciona con células T CD8+
Citotóxicas y HLA-II con Células TCD4+ Helpers.
Los receptores de células T CD8+ o CD4+ sólo pueden reaccionar contra
fragmentos peptídicos exhibidos en el surco presentador de una molécula HLA-I
o HLA-II respectivamente.
Pero los receptores de Células NK no reaccionan contra α2/α3/péptido (extraño),
como ocurre con las células T y solo interactúan con dominios α1 o α3.
Vemos entonces que las moléculas HLA-I pueden funcionar como activadores
de citotoxicidad en células T y represores en células NK.
En el primer caso la citotoxicidad se desencadena por presentación de péptidos
extraños y peligrosos a células T y en el segundo por deprivación de inhibición
“alfa 3” o “alfa 1” a receptores KIR.
Ambos tipos de citotoxicidad, NK y TCD8+, comparten el objetivo de destruir
células potencialmente peligrosas. Esto corporiza el concepto de inmunidad celular.
Las interacciones KIR/HLA son altamente específicas. Por ejemplo, el 50% de
los alelos HLA-C tienen lisina en posición 80 y el otro 50% asparagina en la misma
posición. Los receptores KIR2DL1 reaccionan con HLA-C lisina 80 y los receptores
KIR2DL2, KIR2DL3 y KIR2DS1 lo hacen con HLA-C asparagina 80.
Como vemos, basta el cambio de un AA por otro en posición 80 para que se modifique
la especificidad de la reacción entre un receptor KIR y su ligante MHC-I (HLA-I).
Cada célula NK expresa un panel de receptores KIR de diversa afinidad por
ligantes HLA específicos.
A raíz del polimorfismo HLA y de la diversidad en genes KIR cada individuo
de la especie humana exhibe un apareamiento singular de moléculas KIR-HLA.
Por eso cada individuo exhibe una respuesta innata (NK) y adaptativa (T) exclusiva,
ante el mismo desafio infectológico (84).

LIR
Receptor Leucocitario símil Inmunoglobulinas (LIR) o transcripto similar Ig (ILT).
La familia LIR/ILT se compone de al menos 10 genes que codifican receptores
de inhibición.
Las proteínas LIR también pertenecen a la familia de Inmunoglobulinas, pero
son mucho más promiscuas que los receptores KIR: reconocen un extenso número
de alelos HLA de clase I (HLA-I) pero mayormente HLA-G (85).
El gen LIR se aloja en 19q13.4 y su producto tiene entre 2 y 4 dominios extracelulares
tipo Inmunoglobulinas, un dominio transmembrana (TM) y una larga
proyección intracelular con espacio para dos a cuatro ITIMs.
Los productos de los genes LIR son receptores de inhibición que se presentan
en membranas NKs (23-77%) y en menor proporción también en la superficie de
CTLs, Células B, monocitos, macrófagos y DCs (51).
Los receptores LIR reconocen moléculas MHC-I pero particularmente
HLA-G ubicadas en la superficie de Células Presentadoras de Antígeno (APCs)
y emiten señales inhibidoras de la respuesta inmune. Están diseñadas para controlar
respuestas inflamatorias y citotóxicas, ayudar a focalizar la respuesta inmune y
limitar la autoreactividad.
Debe recordarse que el receptor CD94-NKG2A tipo lectina C, que también funciona
como inhibidor NK, reconoce una molécula HLA-I de bajo nivel de polimorfismo
(HLA-E) mientras que LIR reacciona básicamente con HLA-G (86,51).
Esto indica que son diversos los linajes leucocitarios que adoptaron la estrategia
de reconocer moléculas MHC-I “propias” para controlar la activación de células
inmunes (87,88).
LIR/ILT exhibe un peso molecular de 110 kDa y su función inhibitoria se ejecuta
mediante fosforilación de cuatro ITIMs ubicados en su proyección intracelular.
Los ITIMs fosforilados sirven de anclaje para fosfatasas SHP2 y SH2IP y estas
fosfatasas inhiben las señalizaciones mediadas por receptores de activación (89).
Entre los ligantes de LIR/ILT se incluyen moléculas no clásicas HLA-G,
algunos alelos HLA-A y HLA-B y el producto del gen de CMV humano UL18
(homólogo viral de HLA-I) (90-92).
Los Linfocitos T también expresan (CD85) LIR1/ILT2. En este modelo el
receptor CD85 sirve para modular la activación del complejo TCR/CD3.

NKC / Receptores Lectina tipo C
Las células NK expresan varios receptores transmembrana con función “lectina”
dependiente de Calcio (tipo C), caracterizados por orientación tipo II en
membrana (carboxilo extracelular) (93).
Estas proteínas están codificadas por un grupo de seis genes agrupados en
el locus 12p12.3-p13.1. Salvo NKG2C, que puede estar delecionado en algunos
individuos, todos están bien preservados en ambos haplotipos y exhiben limitado
polimorfismo (94-97).
Es importante señalar que los genes de locus NKC y LRC no están evolutivamente
relacionados, por eso ocupan diferentes localizaciones cromosomales: LRC
en 19q13.4 y NCK en 12p13 (98-101).
La proteína CD94 pertenece a la categoría KLRC (NKC) y está codificada en el
gen KLRD1: miembro 1 de la subfamilia D de receptores killer tipo lectina. Se expresa
en la superficie de células NK apareada a NKG2 (es un heterodímero) (93,102,103).
Estos receptores pueden ser heterodiméricos como CD94/NKG2 u homodiméricos
como NKG2D-NKG2D.
Hay cuatro versiones heterodiméricas: CD94-NKG2A; CD94-NKG2C;
CD94-NKG2E y CD94-NKG2F (104,105).
El receptor heterodimérico CD94/NKG2 reconoce como ligante a la molécula
HLA-E. En comparación con las proteínas HLA-I las moléculas HLA-E
tienen bajo nivel de polimorfismo (106,107).
Los receptores CD94-NKG2A, B, C, E y H, portadores de función lectina
tipo C, sirven también para supervisar la expresión en membrana de moléculas
tipo I de MHC (MHC-I), que aparecen frecuentemente disreguladas por tumores
o infecciones (108-110).
Tanto CD94-NKG2A (inhibidor) como CD94-NKG2E (activador) se
unen a HLA-E con similar afinidad, pero con mayor afinidad que CD94-
NKG2C (activador).
El heterodímero CD94-NKG2C reconoce los mismos ligantes que CD94-
NKG2A pero es activador (111,112).
Durante la respuesta al stress se expresa HSP60 y sus péptidos son degradados
y cargados en moléculas HLA-E. Cuando esto ocurre HLA-E queda bloqueada
para reaccionar con CD94-NKG2A y CD94-NKG2C.
Ergo, el péptido que ocupa el surco presentador de moléculas HLA-E puede
modular la reactividad de algunos receptores lectinas tipo C (113-115).
El homodímero activador NKG2D/NKG2D reacciona con MICA, MICB o
proteínas ligantes “unic long” (de singular longitud) ULBPs.
Las moléculas MICA y MICB son muy parecidas a MHC-I, pero no se
unen a Beta 2 Microglobulina, no tienen función presentadora de antígenos
y solo se expresan cuando la célula es sometida a stress o transformación por
infección u oncogénesis (116).
MICB es una proteína fuertemente glucosilada de gran afinidad por el receptor
activador NKG2D (tipo lectina).
Las proyecciones intracitosólicas de NKG2D están asociadas a subunidades
DAP10 o DAP12, portadoras de ITAMs, por eso funcionan como activadores
citotóxicos NK (117,118).
MICA, MICB y ULBPs solo se expresan en células transformadas por tumor
o infección y nunca aparecen en células normales.
Debe recordarse que MICA y MICB son moléculas polimórficas similares a
MHC-I y ULBPs.
Las ULBPs son glicoproteínas lejanamente relacionadas con MICB que pertenecen
a la familia MHC-I.
La interacción ULBP/NKG2D puede ser bloqueada por una glicoproteína
del Citomegalovirus (CMV) llamada UL16: de esta manera el CMV puede
eludir el ataque del sistema inmune. Las proteínas ULBPs estimulan en NKs la
producción de citokinas y quimiokinas (117,119).
Si bien CD94 no es polimórfico se presenta bajo diversas variantes (A, B, C,
D, E, F, H) e isoformas A y B) (120,121).
El receptor NKG2D exhibe alto grado de identidad y ejerce fuerte citotoxicidad
antitumoral y viral, tanto en ratones como humanos (122-126).
Las células tumorales y muchos virus han desarrollado diversas estrategias para
subvertir la actividad citotóxica NK dependiente de receptores NKG2D (127-130).
Entre los receptores KIR y NKG2 se observa fuerte superposición en el uso de ligantes.
Debido a la multiplicidad de receptores de inhibición, aún la pérdida de un
alelo singular puede ser reconocida por células NK.
La clase HLA-I de la mayoría de los individuos comparte ligantes con receptores
KIR y CD94/NKKG2, por consiguiente NKG2 sirve también para compensar
eventuales falencias cognitivas en el sistema KIR.
La molécula HLA-E complejada con un nonamero derivado de la secuencia
lider de HLA-I es ligante de CD94/NKG2.
La expresión en superficie de HLA-E depende de su unión a un péptido derivado de HLA-I, por eso también funciona como indicador del nivel global de expresión de moléculas HLA-A, B y C (131).
HLA-E puede presentarse asociada a un péptido derivado de la secuencia lider de Hsp60 (un indicador de stress) y este bloquear su reconocimiento por CD94 (115).
De esta manera las células NK pueden reconocer stress celular en células que
todavía expresan MHC-I.
En definitva el sistema CD94/NKG2 respalda la función inhibidora de los
receptores KIR. Su eficiencia depende la las variantes expresivas de HLA-E y el
haplotipo HLA-I dominante en sus blancos potenciales.

NKG2D-NKG2D
El receptor NKG2D-NKG2D es uno de los receptores NK mejor caracterizados
y funciona acoplado al adaptador DAP10 que es portador de secuencia YINM y
señaliza activación vía PI3K y Grb2 (132,133).
De todas maneras las células tumorales pueden eludir la reacción citotóxica
NK liberando gran cantidad de MICA y MICB al plasma o aumentando la degradación
de NKG2D/MICA o B a nivel lisosomal (134-136).
Acorde con recientes datos experimentales las Células NK pueden recordar su
primer encuentro con PAMPs.
Esto fue demostrado recientemente en murinos infectados con Citomegalovirus (MCMV).
En estos animales la función NK está regulada por receptores Ly49 tipo lectina
y uno de ellos (Ly49H) reconoce específicamente una glucoproteína (m157)
codificada por MCMV.
Los receptores Ly49 de inhibición ligan moléculas tipo I MHC (MHC-I)
y los de activación moléculas MHC-I/simil inducibles por stress, infección o
transformación tumoral. La proteína m157 tiene estructura parecida a MHC-I
y reiteramos: es de orígen viral (137).
En murinos infectados con MCMV las células NK/Ly49H+ proliferan fuertemente
en Hígado y Bazo y luego de una fase de contracción, persisten varios meses
en órganos linfoides y no linfoides. La reactivación del MCMV induce en ellas
degranulación y producción de citokinas y su transferencia a animales vírgenes de
contacto con MCMV provee protección inmune.
Esto pone en evidencia que las células NKs desarrollan memoria inmunológica, una propiedad que se creía exclusiva del sistema inmune adaptativo (células B y T) (138).

Compensaciones entre Inhibición y Activación
En un determinado individuo cada célula NK expresa entre 2 y 9 KIRs diferentes
en diversas combinaciones con CD94/NKG2 (139).
Debe existir al menos un inhibidor KIR específico para cada alelo HLA. Cuando
esto no ocurre un inhibidor del sistema CD94/NKG2 compensa el defecto (140).
En definitiva, la modulación de la respuesta citotóxica NK resulta del balance
entre señales positivas y negativas percibido por receptores de moléculas clásicas y
no clásicas de MHC-I (141).

Receptores Naturales de Citotoxicidad (NCR)
Los receptores NCR no reconocen moléculas MHC-I clásicas ni MHC-I “like” inducibles
y son estructuralmente diferentes a todos los receptores descritos hasta ahora.
Tanto en murinos como humanos los inductores de citotoxicidad NK no dependiente
de moléculas Fc, MHC clásicas o “like”, pertenecen a la familia NCR (9).
El sistema NCR se compone de tres receptores de superfamilia de Inmunoglobulinas:
NKp46, NKp44 y NKp30 (142,143,144).
Los NCR se expresan en etapas tempranas del desarrollo de células NK, previo
a la aparición de KIRs y parecen regular la diferenciación de NKs.
NKp44 y NKp46 estarían particularmente relacionados a citotoxicidad contra
células invadidas por virus.
Los ligantes de estos receptores aparecen en células que se encuentran en proceso
de activación, proliferación o transformación tumoral.
Los únicos ligantes de NCRs identificados hasta ahora son Hemaglutininas
virales, expresadas en la superficie de células infectadas (145,146).
El reconocimiento de patógenos por Monocitos, DCs y Macrófagos suele preceder
a la activación de células NK.
Las APCs detectan “patrones moleculares asociados a patógenos” (PAMPs)
mediante receptores específicos (TLRs u otros) y transmiten dicha información a
Células NKs.
Dicha información movilizaría el potencial citotóxico y la producción de citokinas
inflamatorias en células NK. Pero además, acorde con sólidas evidencias
experimentales, las NKs podrían reaccionar con PAMPs de manera directa (147).
De hecho, las células NK humanas pueden reconocer PAMPs mediante TLR-2
y TLR-5 y activar la producción de IFN-γ y α-Defensina sin intermediarios (148).
Las Leishmanias activan en NKs la producción de IFN-γ, sin auxilio de células
accesorias (149,150).
También el Mycobacterim Bovis (BCG) activa la proliferación, citotoxicidad y
producción de IFN-γ en células NK, sin intervención de otros tipos celulares.
La reacción entre NKs y BCG activa en 3 o 4 días la expresión de NKp44.
Esto ocurre específicamente con NKp44 y no con NKp46 ni NKp30 y solo acontece
en células CD56+brillante.
La reacción entre NKp44 y BCG fue demostrada con alto grado de precisión y demuestra que en la pared del BCG hay ligantes afines a NKp44 humano. El mismo fenómeno fue registrado con Nocardia Farcinica y Pseudomonas Aeruginosa.
De esta manera es claro que al menos uno de los miembros de familia NCR, el
NKp44, puede involucrarse de manera directa en el reconocimiento de patógenos
infectantes (151).
NKp30 es un gen polimórfico de activación, involucrado en interacciones entre
DC y NKs, particularmente durante el desarrollo de DCs previo a su migración
a órganos linfoides secundarios (152).
Las DC incrementan la actividad citolítica de las NKs (153).
Los NCRs fueron identificados y molecularmente caracaterizados hace relativamente
poco tiempo. Dentro de esta categoría fueron incorporadas las proteínas
NKp44 (142,154), NKp46 (155,156) y NKp30 (143).
Estas moléculas tienen poca homología con otras proteínas humanas y no se
parecen entre sí.
Dado que su expresión está restringida a células NK constituyen marcadores
precisos para su identificación. Los NCR desempeñan un rol jerárquico en la destrucción
de células tumorales mediadas por NKs.
Más aún existe fuerte correlato entre la densidad de NCRs en membrana y la
magnitud de la reacción citotóxica NK (157-159).
Los receptores NKp46 y NKp30 permiten identificar células NK con precisión,
independientemente de que se encuentren en reposo o actividad. Es importante señalar
que esto no ocurre con los marcadores CD56 y CD16. Por otra parte NKp44
se expresa de manera selectiva en células NK activadas (154,160).
Entre los diferentes NCR ocurre fuerte intercambio de información y amplificación
de señales de activación citotóxica NK. La cooperación entre NCRs facilita
el óptimo reconocimiento y destrucción de las células atacadas (blanco).
La activación de uno u otro NCR resulta en la activación del mismo grupo de
tirosin kinasas y conduce a la fosforilación de diferentes moléculas de traducción
de señales asociadas a receptores.
Por ejemplo CD3ζ está asociado a NKp46 y NKp30 y DAP12 a NKp44.
Como señalaramos más arriba, el estímulo de receptores de inhibición tipo
KIR o CD94/NKG2A suprime las respuestas citotóxicas activables por NCRs.
Este “diálogo” entre receptores de activación está restringido a NCRs dado que
CD16 o KIR2DS4 no participan del mismo (161).

Receptores Activadores DNAM-1
DNAM-1 es una proteína adhesiva leucocitaria de 65 kDa que funciona como
receptor de activación y se expresa de manera constitutiva en NK, Células T, Plaquetas,
Megacariocitos, algunas Células B, Monocitos y Macrófagos.
DNAM-1 está involucrada en activación de plaquetas y macrófagos y progresión
madurativa de Células T CD4+ Naif a fenotipo Th1 (162).
La interacción con sus ligantes Nectina-2 (CD112) y/o PVR (CD155) induce
citotoxicidad y liberación de citokinas en Células NK y T CD8+ (163-165).
Los DNAM-1 regulan la citotoxicidad NK sobre diversos tipos de tumores,
incluídas algunas malignidades hematopoyéticas (164,166,167).

Coreceptores y sus Ligantes
La liberación de actividad citotóxica por células NK resulta del estímulo de varios
receptores de activación. Se incluyen en esta categoría los NCRs NKp30, NKp44
y NKp46, el receptor tipo lectina NKG2D y los KIR/DS. A estos se agregan las
moléculas 2B4m NTB-A y NKp80 que funcionan como “co-receptores”.
Funciona también como coreceptor de activación NK la molécula (GPI-ligada)
CD59, que en Eritrocitos y otras células tiene curiosamente el rol opuesto de inhibir la
citotoxicidad mediada por complemento (ver Complemento y CD59). La activación
de CD59 con antiCD59 (mAb) incrementa la citotoxicidad mediada por NKs (168).
Como ocurre con otros coreceptores NK de activación, el efecto activador NK
de la proteína CD59 depende de la activación simultánea de NCRs.
Acorde con este concepto el efecto “co-activador” de CD59 se restringe a células
NK que exhiban alta concentración de NKp46.
La proteína CD59 se encuentra físicamente asociada cn NKp46 y NKp30.
Más aún, la activación de CD59 provoca tirosino-fosforilación de las cadenas
CD3ζ asociadas a NCRs pero no las asociadas con CD16 (168).
En general estos co-receptores funcionan como amplificadores de la reacción
resultante de la activación simultánea de algun receptor de activación (160).
Los co-receptores 2B4 (CD244), NTB-A, DNAM-1 (CD226), NKp80
son en definitiva amplificadores de los verdaderos receptores (NKG2D, NKp30,
NKp44, NKp46).
Dos de estos co-receptores (2B4 y NTB-A) pueden tener funciones
opuestas acorde con la disponibilidad de reguladores de señales disponibles
corriente abajo (167,169).
Los dominios citoplasmáticos 2B4 y NTB-A tienen afinidad por una proteína
llamada SAP, asociación molecular que es necesaria para liberar señales
de activación NK. Cuando SAP no está ligado ambas moléculas liberan señales
inhibitorias que impiden la liberación de citotoxicidad NK (169,170).
Este efecto inhibitorio ocurre porque en ausencia de SAP la fosfatasa SHP-1
se une al dominio citoplasmático de 2B4 y NTB-A y provoca desfosforilación de
elementos involucrados en activación de NKs.
La mutación desfuncionalizante del gen de proteína SAP provoca Enfermedad
Linfoproliferativa ligada al cromosoma X (XLP). Los pacientes que padecen
XLP exhiben funciones inmunológicas normales hasta que se contagian con virus
Epstein Barr (EBV).
En 70% de los portadores de mutación SAP la Mononucleosis Infecciosa resulta
fatal, precisamente por incapacidad de reacción de las células NK frente al EBV (170).
Es interesante destacar que el bloqueo de 2B4 y NTB-A con mAbs permite
restaurar la respuesta citotóxica NK contra células infectadas con EBV (170).

Fc y FcγRIII
Decíamos más arriba que además de los mencionados receptores KIR, LIR, NKG2
y NCR, las células NK expresan CD16 o sea FcγRIII, que es receptor de la fracción
cristlizable (Fc) de Inmunoglobulinas (171).
La reación antígeno-anticuerpo cubre las céluas o microorganismos con Fc de
inmunoglobulinas y dichos epitopes son reconocidos por FcγRIII de NKs. La activación
del receptor Fc provoca liberación de citotoxicidad y citokinas por células NK.
El mecanismo exacto de activación NK inducido por estímulo de FcγRIII
(CD16) no ha sido totalmente dilucidado. Sin embargo se conocen algunos
datos sugestivos. La estimulación de FcγRIII en NKs produce hidrólisis de
fosfatidil inositol, incrementa la liberación de calcio y activación de tirosin
kinasas. Los mecanismos de transducción de FcγRIII parecen similares a los
de los compejos TCR y FcεRI (171).
La activación de FcγRIII por IgG (Fc) provoca “Citotoxicidad Celular Dependiente
de Anticuerpos” (ADCC) y transmisión de señales a otras células, mediante
liberación de IFN-γ y otras citokinas
La citotoxicidad vía FcγRIII se ejecuta vía perforina y granzyme como ocurre
con otros receptores NK de activación y también está sujeta a modulación por
receptores NK de inhibición (172).
El fenómeno ADCC exije contacto célula-célula y la reacción entre FcγRIII
y Fc libre (IgG) lo impide. Por eso el Fc soluble ejerce también efecto modulador
sobre ADCC (173).
En definitiva ADCC constituye otro punto de contacto entre los sistemas
Inmune Innato (NKs) y adaptativo (anticuerpos).

Células T Natural Killers (NKT)
Las Células NKT conforman un grupo heterogéneo de Células T que comparte
propiedades de células T y NK.
A diferencia de las células T convencionales los TCRαβ de NKTs solo reconocen
antígenos lipídicos o glucolipídicos expuestos en moléculas CD1d, que
constituyen una variante de moléculas CD1.
Las NKTs expresan TCRs de repertorio antigénico mucho más restringido y
tienen la singular propiedad de liberar tanto citokinas tipo Th1 como Th2 (174).
Estas células representan menos del 1% del total de células T circulantes (175).
Las NKTs coexpresan un TCRαβ de cadena α “inavariable” (i) con receptores
típicos de células NK.
El glucoesfingolípido isoglobotrihexocilceramide (iGb3) constituye uno de sus ligantes
más importantes y es reconocido tanto por células NKT humanas como murinas.
Los animales transgénicos que no expresan iGb3 lisosomal ni hexosaminidasa,
exhiben fuerte disminución en células NKT, lo cual pone en evidencia que dicho
ligante es crítico para el desarrollo de estas células.
La expresión de iGb3 en tejidos periféricos parece ser necesaria para el control
de la respuesta NKT ante infecciones, malignidad y autoinmunidad (176).
La cadena α “invariable” (i) TCR de NKT es importante para el reconocimiento
de patógenos microbianos como Borrelia Burgdorferi (enfermedad de Lyme)
De hecho los animales transgénicos que carecen de α(i)TCR en NKTs,
padecen dolores artríticos más severos y prolongados y reducida capacidad para
liberar de espiroquetas los tejidos infectados (177).
Las NKTs desempeñan tareas importantes en regulación de respuestas autoinmunes,
alérgicas, antimicrobianas y antitumorales (178).
Hay células NKT que marcan CD4+, CD8- o ambos co-receptores negativos
y también NK1.1+ y NK1.1-. Además comparten con las células NK marcadores
CD16, CD56 y producción de Perforina y Granzyme.
La activación de NKT induce la liberación de grandes cantidades de Interferon
Gamma, IL-4 y GM-csf u otras citokinas y quimiokinas como TNFα e IL-2 (179).
La desfuncionalización o deleción de células NKT puede activar fenómenos
autoinmunes u oncológicos. También se ha relacionado la deficiencia en NKT con
la intensificación de asma bronquial.
Las células NKT y Tregs (CD4+CD25+) son reguladoras de respuestas inmunes
innata y adaptativa. Las células NKT modulan de manera cuali-cuantitativa
la función de células Treg mediante mecanismos dependientes de IL-2. Por otra
parte las Tregs suprimen la proliferación, liberación de citokinas y actividad citotóxica
de las NKT vía contactos célula-célula. Además ambos tipos celulares (NKT
y Treg) comparten importantes rutas de señalización (180).
Tanto la activación como el desarrollo de NKTs dependen de ligantes glucolipídicos
presentados en moléculas CD-1d por Células Presentadoras de Antígenos
(APCs) (181).
Además de iGb3, las células NKT reconocen diacilglicerol sobre la bacteria
Borrelia Burgdorferi que es causante de la Enfermedad de Lyme.
La potencia de este antígeno depende de la longitud y nivel de saturación de su
componente lipídico. Mediante este ligante la Borrelia induce en NKTs proliferación y
producción de citokinas. Acorde con los datos hasta ahora reunidos las NKT reconocen
diversa categoría de glucolípidos aparte iGb3 y pueden proveer protección
contra diverso tipo de patógenos (182).




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*capitulo extraído del libro: El Sistema Inmune: Genética, Biología Molecular, Clínica, Farmacología / Autores: Ricardo Antonio Giuliani y Eleno Martínez Aquino - 1a. Ed. - Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.
Eritroferon S.R.L., 2011.
ISBN 978-987-27121-0-5