cap. 6. Quimiokinas y Defensinas
Autor:
Ricardo Antonio Giuliani
Quimiokinas
Las Quimioquinas constituyen una familia de pequeñas proteínas básicas, ricas en Cisteína, de gran afinidad por Glucosaminoglicanos (GAGs) como Heparina, Heparán Sulfato, Dermatán Sulfato, Condroitin Sulfato y proteína Duffy (1,2,3).
Son “Cito-kinas Quimio-atrayentes” segregadas por células de tejidos inflamados y derivan su nombre de esta caracterización funcional (kinesis=movimiento).
Controlan migraciones celulares que intervienen en el desarrollo y mantenimiento de ciertos tejidos, en respuesta inmune y procesos inflamatorios.
Estas proteínas de 8-10 kDa, 70 a 100 AA de largo y homología de 25% a 50%, presentan una forma de llave griega de alta preservación funcional y evolutiva.
Dicha estructura resulta de uniones disulfuro entre cuatro cisteínas, donde la primera se liga a la tercera y la segunda a la cuarta (4).
Las Quimiokinas son producidas como propéptidos, encabezados por un péptido señal de unos 20 AA que es separado de la región madura durante el proceso de secreción celular. Hasta ahora han sido descritas más de cincuenta Quimiokinas, algunas de ellas con funciones redundantes (4).
Receptores de Quimiokinas
Los receptores de Quimiokinas son proteínas de 7 pasos trans-membrana (7TM) que tienen un terminal carboxilo intracelular acoplado a un Complejo de Proteínas G (5).
Las “Proteínas G” son ligantes de Nucleótidos de Guanina y funcionan como llaves moleculares que habilitan o interrumpen la emisión de señales, acorde con la incorporación (GTP) o liberación (GDP) de Fosfato. El reemplazo de Guanidin Di Fosfato (GDP) por Guanidin Tri Fosfato (GTP) activa
señalizaciones que son extinguidas por la GTPasa intrínseca de la subunidad α, que degrada GTP a GDP (6).
Hay dos tipos de Proteínas G: Heterotriméricas o “grandes” y Monoméricas o “pequeñas”. Las grandes están acopladas a receptores de proteína G, como ocurre con los Receptores de Quimiokinas, e integran un complejo formado por subunidades “G” α, β y γ. Las pequeñas pertenecen a la superfamilia Ras de GTPasas y son homólogas a la subunidad α, que en el complejo Gαβγ es
portadora de GDP/GTP (6).
El receptor 7TM reacciona con su Quimiokina y sufre un cambio conformacional que lo convierte en “factor de intercambio de nucleótidos de guanina”, provocando en la subunidad α el cambio de GDP por GTP. Esta actividad se conoce en inglés como “Guanidin Nucelotide Exchange Factor” (GEF).
Mediante incorporación de un grupo Fosfato adicional (GTP) la subunidad α adquiere suficiente energía como para disociarse del dímero βγ y alcanzar su blanco funcional (7, 8).
Este es un ejemplo más de rutas dependientes de adición o sustracción de Fósforo y corporiza un medio muy económico y veloz de activar y desactivar señalizaciones.
La transformación de GTP en GDP reduce la energía de la subunidad α (Gα) a un nivel apto para su reasociación con el dímero βγ. La regeneración del complejo Gα-GDP/βγ/receptor brinda las condiciones necesarias para el inicio de un nuevo ciclo de activación.
Hay proteínas activadoras de GTPasa (GAP) que son específicas de Gα y funcionan como aceleradores de hidrólisis y de esta manera como interruptores de señales. En algunos casos el propio efector de la reacción puede tener función GAP, como ocurre con la Fosfolipasa C-β (PLCβ) que posee actividad GAP a nivel carboxi terminal (9).
Tanto Gα-GTP como Gβγ pueden activar diferentes cascadas de señales o rutas de “mensajeros secundarios” y hacer blanco en proteínas efectoras.
En mamíferos han sido descritos 19 receptores de Quimiokinas. La interacción con sus ligantes induce liberación de calcio desde el retículo endoplásmico hacia el citosol y provoca movilización celular (Quimiotaxis) (10).
Los leucocitos se desplazan hacia el sitio donde se originó determinada Quimiokina siguiendo el derrotero de su concentración. Los receptores Toll Like (TLR), ya descritos en Biología de Célula T, reaccionan con patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) incrementando la producción de Quimiokinas.
Este tipo de receptor (TLR) tiene alto nivel de expresión en células B, T y presentadoras de antígenos (APCs) (11,12).
Las Quimiokinas desempeñan un papel de primer orden en el tráfico normal de linfocitos hacia los órganos linfoides primarios y secundarios (13,14).
Una amplia variedad de células desencadena fenómenos inflamatorios mediante la liberación de Quimiokinas atrayentes de Neutrófilos, Monocitos y otras Células Efectoras. Las Quimiokinas intervienen también en angiogénesis, ma153 Q uimi o k inas y D efensinas duración, morfogénesis, fenómenos de destrucción tisular asociados a enfermedades autoinmunes, arterioesclerosis, rechazo de alloinjertos y neoplasia (10,15).
De hecho hay diversas empresas farmacéuticas compitiendo en el desarrollo de inhibidores de receptores de Quimiokinas para el control de diversas enfermedades.
Las Quimiokinas se clasifican acorde con la ubicación de los residuos Cisteína en la molécula: C=Cisteína y X=cualquier aminoácido (AA). Hasta ahora han sido reconocidas cuatro familias: CxC (dos Cisteínas separadas por un AA), CC (dos Cisteínas seguidas), xC (una sóla Cisteína precedida por un AA) y Cx3C (dos Cisteínas separadas por tres AA) (16).
Los miembros que integran cada familia son identificados por un número que sigue a la letra L=Ligante y su receptor es identificado por la letra R. Dado que existe bastante promiscuidad entre ligantes y receptores de Quimiokinas, la numeración de los receptores no siempre es correlativa con la numeración de sus ligantes.
Muchas proteínas, identificadas desde hace años bajo diversos nombres, integran ahora la clasificación de Quimiokinas con su sigla correspondiente (16).
El Factor Plaquetario 4 (PF4) es el CxCL4, Stromal Derived Growth Factor (SDF-1) es el CxCL12, RANTES es el CCL5, sólo para mencionar algunas.
Como ocurre también con la nomenclatura CD, muchas veces la designación histórica domina sobre la moderna clasificación (17,18).
El PF4 y su actividad neutralizante de la heparina, que motivara debate años atrás, es en realidad una Quimiokina y por eso tiene afinidad por la heparina (17).
Siglas complejas como RANTES, derivadas de regulated upon activation of normal T cell expresed and secreted, quedarán simplemente expresadas como CCL5 (19).
La Interleukina-8 (IL-8) es una Quimiokina que pertenece a la familia CXC (CxCL8) y constituye uno de los mediadores de inflamación más importantes del organismo. Este factor angiogénico y quimioatrayente se expresa en diversos linajes celulares, particularmente macrófagos y células
endoteliales. La estimulación prolongada de células endoteliales induce síntesis y acumulación de IL-8 en corpúsculos de Weibel-Palade. Allí persiste varios días aunque haya sido removido el estímulo original y la célula endotelial queda preparada para responder rápidamente ante nuevas agresiones,
sin necesidad de recurrir a síntesis de novo de IL-8. El gen de IL-8/CXC se localiza en cromosoma 4q (20, 21,17).
La Quimiokina IL-8 (CXCL8) se une con gran afinidad a receptores de IL-8 alfa (CXCR1) y beta (CXCR2), codificados por genes IL8RA e IL8RB localizados en el locus 2q33-q36. La integridad de estos genes es crítica para un desarrollo embriológico normal. Los receptores CXCR1 y CXCR2 activados señalizan vía proteínas G acopladas a su proyección citosólica (22,23,24).
Para que se constituya una reacción inflamatoria, es necesario que los leucocitos puedan migrar desde la circulación hacia los tejidos, a través del endotelio y su membrana basal. Las Quimioquinas, producidas en el tejido inflamado dirigen estos mecanismos de extravasación.
Cuando se inyecta IL-8 (CxCL8) o el Quimioatrayente N-Formyl-Metionil-Leucil-Ph(F)enilalanina (FMLP), en piel de rata, el primer cambio morfológico que se registra es el desarrollo de microvellosidades o “arrugas” en la superficie endotelial. Esto ocurre 5 minutos después de la inyección y antes de producirse marginación o transmigración de Neutrófilos (25,26).
Luego comienza a observarse un aumento progresivo de IL-8 (CxCL-8) en el endotelio, siguiendo un trayecto de transcitosis desde su cara contraluminal a la superficie. Dentro de la célula, las Quimiokinas son transportadas en estructuras subcelulares llamadas “caveolas”, que son pequeñas vesículas especializadas en el tráfico de moléculas entre grupos de vesículas y vacuolas. La confluencia de caveolas habilita el desarrollo de poros transendoteliales (1,27).
Cuando las caveolas se fusionan con la membrana luminal, las Quimiokinas son derramadas sobre la membrana, concentrándose en la punta de las microvellosidades del endotelio activado. Esta disposición espacial maximiza su presentación a los leucocitos en fase de “rodamiento”. Los Glucosaminoglicanos de la superficie, de fuerte carga electronegativa, inmovilizan a las Quimiokinas e impiden su “lavado” por el torrente circulatorio (28,3).
Estas moléculas interactúan con los receptores “serpentina” acoplados a “proteínas G”, que se encuentran en la superficie leucocitaria, liberando señales activadoras de integrinas. Las integrinas activadas reaccionan con sus ligantes sobre la superficie endotelial y los leucocitos se adhieren fuertemente a la superficie.
Comienza ahora la migración leucocitaria desde el lúmen hacia los tejidos, directamente a través de túneles endoteliales caveola-dependientes o siguiendo desfiladeros interendoteliales. La IL-8 (CxCL-8) se localiza en caveolas y grandes vesículas y no en las uniones interendoteliales, por consiguiente facilitan únicamente la vía transendotelial de extravasación leucocitaria (29).
Una vez alcanzada la membrana basal, los leucocitos siguen el gradiente de Quimiokinas, libres o fijas a GAGs, hasta llegar al sitio inflamatorio que los convocara.
Las Quimiokinas exhiben un alto grado de variación en su afinidad por la heparina y otros Glucosaminoglicanos (GAGs). Por otra parte la concentración y tipo de GAGs, en la superficie de las células endoteliales, varía acorde con el tipo de lecho vascular donde se encuentran. Las células endoteliales demuestran flexibilidad respecto de la expresión del tipo de GAGs y estructura fina de sus cadenas de carbohidratos (30,31).
Variaciones en las secuencias de carbohidratos y el posicionamiento de los grupos con carga negativa y variaciones en la secuencia de AA en las diversas citokinas, contribuyen a la selectividad de las interacciones GAGs-Quimiokinas. Es posible entonces que estas diferencias estructurales en GAGs y Quimiokinas determinen sus niveles de afinidad y su selectividad hacia los tipos y subgrupos de leucocitos reclutados. Dichas especificidades podrían también influir en los gradientes de citokinas y ordenar el ritmo del tráfico leucocitario (32,33).
El antígeno Duffy, muy popular entre hemoterapeutas, fue originalmente descrito en eritrocitos y funciona como receptor de Quimiokinas (DARC) (34).
La sigla DARC surge de “Duffy Antigen Receptor for Chemokines. La migración transendotelial de Neutrófilos hacia sitios de inflamación depende de la interacción entre el receptor DARC y la Quimiokina CxC8 (35,36).
DARC es una proteína de 7 pases de membrana (7 regiones hidrofóbicas), no acoplada a “proteínas -G”, que se encuentra Eritrocitos, algunas Células Epiteliales, Células de Purkinje de Cerebelo, Células Endoteliales de Capilares Tiroideos y Células Endoteliales de Vénulas Post-Capilares de ciertos órganos y grandes vénulas pulmonares (37).
No ha sido detectado en endotelios arteriales o arteriolares. El Duffy es un receptor de Quimiokinas de amplia especificidad de unión para miembros de las familias CC y CxC excepto MIP-1, MIP-1β y XCL1. El DARC podría funcionar en los mecanismos de endocitosis y transcitosis de Quimiokinas, dado que se lo encuentra característicamente asociado a caveolas formadoras de vesículas de
transporte intracelular (38,39).
En el modelo de inflamación más probable, las Quimiokinas serían reconocidas por DARCs en caveolas y de esta manera podrían viajar hasta el lumen endotelial para ser derramadas sobre una superficie rica en GAGs. Los GAGs fijarían estas citokinas en los extremos de las proyecciones endoteliales y los presentarían a los leucocitos circulantes. El tipo de leucocito a ser transportado, siguiendo el gradiente de Quimiokinas, dependerá entonces del tipo de GAGs y del tipo de Quimiokinas involucradas en el proceso inflamatorio (40).
Defensinas
Las Defensinas son “Antibióticos Peptídicos” naturales que desempeñan importantes tareas en el campo de la inmunidad innata y se encuentran tanto en plantas como animales, desde insectos hasta humanos.
Las Defensinas de los mamíferos son moléculas básicas muy activas contra hongos, bacterias y virus, de pequeño tamaño (18-45 AA) y alta preservación evolutiva. Estas moléculas exhiben una estructura “hoja beta” en la que se reconocen 6 a 8 Cisteínas y dos o tres puentes disulfuro intramoleculares que
le confieren estabilidad. Su fuerte hidrofobicidad les permite infiltrar, instalar poros y permeabilizar membranas de agentes microbianos (41).
Los genes que codifican Defensinas son altamente polimórficos, sin embargo ciertos aspectos estructurales se encuentran altamente preservados.
En función de sus diferencias estructurales, en mamíferos se distinguen tres clases principales de Defensinas: Alfa (α), Beta (β) y Theta (θ).
Las alfa (α) Defensinas se encuentran predominantemente en neutrófilos, en sus equivalentes intestinales llamados Células de Paneth y en ciertas poblaciones de macrófagos.
Las beta (β) Defensinas se expresan preferentemente en leucocitos y células epitaliales.
A pesar de sus diferencias en secuencia de DNA y apareamiento de puentes disulfuro, las familias alfa y beta defensinas parecen haber evolucionado a partir de un gen pre-mamífero común bastante ancestral.
En humanos, la única versión disponible en Theta (θ) Defenisina o “Retrociclina”, son múltiples pseudogenes que poseen un Codon Stop que permite la transcripción a mRNA pero no su traducción a péptidos (41,42).
Las Defensinas se expresan de manera constitutiva y también en respuesta a productos microbianos o citokinas pro-inflamatorias. Algunas Defensinas inhiben la producción de corticoides por competencia con el receptor de corticotropina, por eso son también llamadas corticostatinas (43).
La topología polar de estas moléculas, con regiones hidrofóbicas de carga positiva separadas espacialmente, habilita su inserción en las membranas fosfolipídicas.
Dichas regiones catiónicas reaccionan con las cabezas aniónicas fosfolipídicas y dan lugar al agregado de otras Defensinas hasta formar poros tubulares o bien cubren la membrana microbiana y de esta manera facilitan su fagocitosis.
En virtud de su condición de lectinas las alfa Defensinas pueden suprimir la activación de la vía clásica del complemento por captación de C1q.
En definitiva, estas proteínas despliegan un amplio rango de efectos: promueven el reclutamiento de neutrófilos, estimulan la fagocitosis, suprimen mediadores anti-inflamatorios e incrementan la producción de citokinas pro-inflamatorias. En conjunto las Defensinas articulan mecanismos de defensa innata y recursos inflamatorios contra agentes microbianos.
El mecanismo de acción de las Defensinas no parece restringirse a acciones directas sobre membranas o envolturas de partículas virales. También pueden ejercer actividad antiviral mediante inhibición de ciertas rutas de señales, como aquellas vinculadas a la activación de la Proteína Kinasa C (44).
Alfa (α) Defensinas
En humanos fueron descritas hasta ahora seis alfa (α) Defensinas, caracterizadas como pequeños péptidos ricos en arginina que desempeñan importantes roles en diversos procesos relacionados con tareas defensivas anti-microbianas.
Son efectores y reguladores de inmunidad innata a la vez que estimuladores de respuestas inmunes adaptativas.
Las Defensinas alfa humanas fueron identificadas con la sigla HNP que surge de Human (H), Neutrphils(N), Peptide (P) o “Human Neutrophil-derived alpha-defensins”. Los Neutrófilos Humanos tienen grandes cantidades de Alfa Defensinas HNP-1/HPN-3 y también HPN-4 aunque en menor cantidad.
Las alfa Defensinas HD5 y HD6 se expresan mayormente en Células de Paneth, que constituyen el equivalente de los Neutrófilos a nivel del intestino delgado. Ver Inmunidad de Mucosas (45,46).
La activación de Receptores Citoplasmáticos de Peptidoglicanos como Nod2, induce la expresión intestinal de Alfa Defensinas y de hecho la Ileitis Regional de Crohn se vincula a mutaciones en este receptor (45,46,47).
Las Defensinas alfa de origen humano HNP3, HNP4, HD5 y HD6, adoptan conformación dimérica y comparten la misma estructura terciaria con alfa y beta Defensinas, pero guardan entre sí poca homología estructural.
Las alfa Defensinas HNP1-4 tienen similar actividad antimicrobiana y quimiotactica pero las alfa Defensinas intestinales carecen de actividad quimiotactica (47).
Las Defensinas de Neutrófilos HNP-1/HPN-3 poseen interesantes propiedades antivirales y antitoxicas. Las HNPs incrementan la fagocitosis de macrófagos en ratones, HNP1-3aumentan la producción de TNF e IL-1 y decrementan la expresión de IL-10 por los monocitos.
Las Defensinas-Alfa (α), se expresan en Neutrófilos, Macrófagos y Células de Paneth del Intestino, donde colaboran en el mantenimiento de un correcto balance microbiano. Sus genes codificantes son DEFA1- DEFA6.
Beta Defensinas (β)
Hasta mediados de la década del 90 sólo se conocían Beta Defensinas en gallinas y ganado bovino. En humanos se describió la primera de ellas en 1995 (hBD-1) y la segunda en 1997 (hBD-2). La sigla corresponde a “human Beta Defensin” y el número corresponde a cada versión descrita en humanos (42,48,49).
Las Defensinas Beta (β) tienen pequeño tamaño, alta densidad de carga catiónica (básica) y seis motivos Cisteína. Los genes de Defensinas Beta están conformados por dos Exones: el primero codifica la secuencia hidrofóbica líder y el segundo los péptidos ricos en Cisteínas. Las Defensinas-Beta (β) están ampliamente distribuidas y son segregadas por neutrófilos y diverso tipo de
Células Epiteliales. Se pueden encontrar en lengua, piel, córnea, glándulas salivares, riñón, esófago y tracto respiratorio.
Los Macrófagos y Monocitos no expresan Defensinas pero sí liberan mensajeros inductores de Beta Defensinas en Células Epiteliales.
El reconocimiento de Moléculas Asociadas a Patógenos (PAMPs) por Receptores Toll (like) induce en Células Epiteliales la liberación de Beta Defensinas.
Las hBD-1, hBD-2 y hBD3 despliegan fuerte actividad microbicida contra bacterias Gram-negativas como Pseudomonas Aeruginosa o Escherechia Coli y contra hongos como Candida Albicans y Malassezia Furfur. hBD-3 destruye además Gram-positivos como Streptococcus Pyogenes o Staphylococcus Aureus, incluyendo cepas multiresistentes de la misma estirpe o vancomicino-resistentes como Enterococcus Faecium. Se ha demostrado fuerte expresión de hBD-1 y hBD2 en
tejidos no-epiteliales como leucocitos, músculo cardíaco y esquelético (50).
Los Neutrófilos que tienen jerarquía de “fagocitos profesionales”, producen mayormente Defensina Beta y la empaquetan en sus gránulos azurófilos. El 30-50% de las proteínas acumuladas en dichos gránulos está constituido por Defensinas y el resto por otros agentes microbianos, elastasa y catepsina G (51).
La mayor parte de las Defensinas descritas en mamíferos son de familia Beta y están codificadas por una amplia gama de genes: DEFB1, DEFB4, DEFB103A, DEFB103B a DEFB107A/B, DEFB110 a DEFB133.
Las defensinas epteliales humanas hBD1, hBD2 y hBD3 se expresan en Piel de Humanos. Se ha establecido una clara asociación entre inflamación, producción de IL-1 y expresión de hBD-2.
La reacción PAMPs/TLRs descarga señales de activación al interior de los Neutrófilos, estos derraman el contenido de sus gránulos sobre la superficie de los microbios y ponen en marcha su maquinaria de fagocitosis (52,53).
Proyecciones farmacológicas en relación con HIV u otros virus
En el mono Macacus Rhesus se expresa el gen Theta-Defensina sin el mencionado Codon Stop del humano y su producto es un octadecapéptido cíclico catiónico (18 AA) llamado Theta (θ) Defensina (Retrociclina), de gran actividad antiviral, particularmente anti-HIV. La producción de theta-defensinas en el Macacus Rhesus involucra el ligado postraduccional de dos nonapéptidos, cada uno derivado de un precursor de 12 AA llamado “semidefensina”.
En humanos fue posible restaurar la expresión endógena de Retrociclinas con aminoglucósidos y esto abre la posibilidad de prevenir o tratar la infección por HIV mediante manipulación farmacológica de los mencionados pseudogenes Theta (θ) Defensina (54).
La Retrociclina-1 es un peptido sintético theta-defensina a partir de precursores codificados por pseudogenes theta-defensina humanos (θHD). La retrociclina-1 protege a linfocitos humanos de la infección con cepas R5 y X4 de HIV-1 y constituye un modelo para el diseño de novedosos agentes antivirales.
En suma, los productos de síntesis, que recibieron el nombre de Retrociclinas 1 y 2, pueden inhibir la replicación del Virus Thai HIV-1 (55).
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*capitulo extraído del libro: El Sistema Inmune: Genética, Biología Molecular, Clínica, Farmacología / Autores: Ricardo Antonio Giuliani y Eleno Martínez Aquino - 1a. Ed. - Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.
Eritroferon S.R.L., 2011.
ISBN 978-987-27121-0-5
Ricardo Antonio Giuliani
Quimiokinas
Las Quimioquinas constituyen una familia de pequeñas proteínas básicas, ricas en Cisteína, de gran afinidad por Glucosaminoglicanos (GAGs) como Heparina, Heparán Sulfato, Dermatán Sulfato, Condroitin Sulfato y proteína Duffy (1,2,3).
Son “Cito-kinas Quimio-atrayentes” segregadas por células de tejidos inflamados y derivan su nombre de esta caracterización funcional (kinesis=movimiento).
Controlan migraciones celulares que intervienen en el desarrollo y mantenimiento de ciertos tejidos, en respuesta inmune y procesos inflamatorios.
Estas proteínas de 8-10 kDa, 70 a 100 AA de largo y homología de 25% a 50%, presentan una forma de llave griega de alta preservación funcional y evolutiva.
Dicha estructura resulta de uniones disulfuro entre cuatro cisteínas, donde la primera se liga a la tercera y la segunda a la cuarta (4).
Las Quimiokinas son producidas como propéptidos, encabezados por un péptido señal de unos 20 AA que es separado de la región madura durante el proceso de secreción celular. Hasta ahora han sido descritas más de cincuenta Quimiokinas, algunas de ellas con funciones redundantes (4).
Receptores de Quimiokinas
Los receptores de Quimiokinas son proteínas de 7 pasos trans-membrana (7TM) que tienen un terminal carboxilo intracelular acoplado a un Complejo de Proteínas G (5).
Las “Proteínas G” son ligantes de Nucleótidos de Guanina y funcionan como llaves moleculares que habilitan o interrumpen la emisión de señales, acorde con la incorporación (GTP) o liberación (GDP) de Fosfato. El reemplazo de Guanidin Di Fosfato (GDP) por Guanidin Tri Fosfato (GTP) activa
señalizaciones que son extinguidas por la GTPasa intrínseca de la subunidad α, que degrada GTP a GDP (6).
Hay dos tipos de Proteínas G: Heterotriméricas o “grandes” y Monoméricas o “pequeñas”. Las grandes están acopladas a receptores de proteína G, como ocurre con los Receptores de Quimiokinas, e integran un complejo formado por subunidades “G” α, β y γ. Las pequeñas pertenecen a la superfamilia Ras de GTPasas y son homólogas a la subunidad α, que en el complejo Gαβγ es
portadora de GDP/GTP (6).
El receptor 7TM reacciona con su Quimiokina y sufre un cambio conformacional que lo convierte en “factor de intercambio de nucleótidos de guanina”, provocando en la subunidad α el cambio de GDP por GTP. Esta actividad se conoce en inglés como “Guanidin Nucelotide Exchange Factor” (GEF).
Mediante incorporación de un grupo Fosfato adicional (GTP) la subunidad α adquiere suficiente energía como para disociarse del dímero βγ y alcanzar su blanco funcional (7, 8).
Este es un ejemplo más de rutas dependientes de adición o sustracción de Fósforo y corporiza un medio muy económico y veloz de activar y desactivar señalizaciones.
La transformación de GTP en GDP reduce la energía de la subunidad α (Gα) a un nivel apto para su reasociación con el dímero βγ. La regeneración del complejo Gα-GDP/βγ/receptor brinda las condiciones necesarias para el inicio de un nuevo ciclo de activación.
Hay proteínas activadoras de GTPasa (GAP) que son específicas de Gα y funcionan como aceleradores de hidrólisis y de esta manera como interruptores de señales. En algunos casos el propio efector de la reacción puede tener función GAP, como ocurre con la Fosfolipasa C-β (PLCβ) que posee actividad GAP a nivel carboxi terminal (9).
Tanto Gα-GTP como Gβγ pueden activar diferentes cascadas de señales o rutas de “mensajeros secundarios” y hacer blanco en proteínas efectoras.
En mamíferos han sido descritos 19 receptores de Quimiokinas. La interacción con sus ligantes induce liberación de calcio desde el retículo endoplásmico hacia el citosol y provoca movilización celular (Quimiotaxis) (10).
Los leucocitos se desplazan hacia el sitio donde se originó determinada Quimiokina siguiendo el derrotero de su concentración. Los receptores Toll Like (TLR), ya descritos en Biología de Célula T, reaccionan con patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) incrementando la producción de Quimiokinas.
Este tipo de receptor (TLR) tiene alto nivel de expresión en células B, T y presentadoras de antígenos (APCs) (11,12).
Las Quimiokinas desempeñan un papel de primer orden en el tráfico normal de linfocitos hacia los órganos linfoides primarios y secundarios (13,14).
Una amplia variedad de células desencadena fenómenos inflamatorios mediante la liberación de Quimiokinas atrayentes de Neutrófilos, Monocitos y otras Células Efectoras. Las Quimiokinas intervienen también en angiogénesis, ma153 Q uimi o k inas y D efensinas duración, morfogénesis, fenómenos de destrucción tisular asociados a enfermedades autoinmunes, arterioesclerosis, rechazo de alloinjertos y neoplasia (10,15).
De hecho hay diversas empresas farmacéuticas compitiendo en el desarrollo de inhibidores de receptores de Quimiokinas para el control de diversas enfermedades.
Las Quimiokinas se clasifican acorde con la ubicación de los residuos Cisteína en la molécula: C=Cisteína y X=cualquier aminoácido (AA). Hasta ahora han sido reconocidas cuatro familias: CxC (dos Cisteínas separadas por un AA), CC (dos Cisteínas seguidas), xC (una sóla Cisteína precedida por un AA) y Cx3C (dos Cisteínas separadas por tres AA) (16).
Los miembros que integran cada familia son identificados por un número que sigue a la letra L=Ligante y su receptor es identificado por la letra R. Dado que existe bastante promiscuidad entre ligantes y receptores de Quimiokinas, la numeración de los receptores no siempre es correlativa con la numeración de sus ligantes.
Muchas proteínas, identificadas desde hace años bajo diversos nombres, integran ahora la clasificación de Quimiokinas con su sigla correspondiente (16).
El Factor Plaquetario 4 (PF4) es el CxCL4, Stromal Derived Growth Factor (SDF-1) es el CxCL12, RANTES es el CCL5, sólo para mencionar algunas.
Como ocurre también con la nomenclatura CD, muchas veces la designación histórica domina sobre la moderna clasificación (17,18).
El PF4 y su actividad neutralizante de la heparina, que motivara debate años atrás, es en realidad una Quimiokina y por eso tiene afinidad por la heparina (17).
Siglas complejas como RANTES, derivadas de regulated upon activation of normal T cell expresed and secreted, quedarán simplemente expresadas como CCL5 (19).
La Interleukina-8 (IL-8) es una Quimiokina que pertenece a la familia CXC (CxCL8) y constituye uno de los mediadores de inflamación más importantes del organismo. Este factor angiogénico y quimioatrayente se expresa en diversos linajes celulares, particularmente macrófagos y células
endoteliales. La estimulación prolongada de células endoteliales induce síntesis y acumulación de IL-8 en corpúsculos de Weibel-Palade. Allí persiste varios días aunque haya sido removido el estímulo original y la célula endotelial queda preparada para responder rápidamente ante nuevas agresiones,
sin necesidad de recurrir a síntesis de novo de IL-8. El gen de IL-8/CXC se localiza en cromosoma 4q (20, 21,17).
La Quimiokina IL-8 (CXCL8) se une con gran afinidad a receptores de IL-8 alfa (CXCR1) y beta (CXCR2), codificados por genes IL8RA e IL8RB localizados en el locus 2q33-q36. La integridad de estos genes es crítica para un desarrollo embriológico normal. Los receptores CXCR1 y CXCR2 activados señalizan vía proteínas G acopladas a su proyección citosólica (22,23,24).
Para que se constituya una reacción inflamatoria, es necesario que los leucocitos puedan migrar desde la circulación hacia los tejidos, a través del endotelio y su membrana basal. Las Quimioquinas, producidas en el tejido inflamado dirigen estos mecanismos de extravasación.
Cuando se inyecta IL-8 (CxCL8) o el Quimioatrayente N-Formyl-Metionil-Leucil-Ph(F)enilalanina (FMLP), en piel de rata, el primer cambio morfológico que se registra es el desarrollo de microvellosidades o “arrugas” en la superficie endotelial. Esto ocurre 5 minutos después de la inyección y antes de producirse marginación o transmigración de Neutrófilos (25,26).
Luego comienza a observarse un aumento progresivo de IL-8 (CxCL-8) en el endotelio, siguiendo un trayecto de transcitosis desde su cara contraluminal a la superficie. Dentro de la célula, las Quimiokinas son transportadas en estructuras subcelulares llamadas “caveolas”, que son pequeñas vesículas especializadas en el tráfico de moléculas entre grupos de vesículas y vacuolas. La confluencia de caveolas habilita el desarrollo de poros transendoteliales (1,27).
Cuando las caveolas se fusionan con la membrana luminal, las Quimiokinas son derramadas sobre la membrana, concentrándose en la punta de las microvellosidades del endotelio activado. Esta disposición espacial maximiza su presentación a los leucocitos en fase de “rodamiento”. Los Glucosaminoglicanos de la superficie, de fuerte carga electronegativa, inmovilizan a las Quimiokinas e impiden su “lavado” por el torrente circulatorio (28,3).
Estas moléculas interactúan con los receptores “serpentina” acoplados a “proteínas G”, que se encuentran en la superficie leucocitaria, liberando señales activadoras de integrinas. Las integrinas activadas reaccionan con sus ligantes sobre la superficie endotelial y los leucocitos se adhieren fuertemente a la superficie.
Comienza ahora la migración leucocitaria desde el lúmen hacia los tejidos, directamente a través de túneles endoteliales caveola-dependientes o siguiendo desfiladeros interendoteliales. La IL-8 (CxCL-8) se localiza en caveolas y grandes vesículas y no en las uniones interendoteliales, por consiguiente facilitan únicamente la vía transendotelial de extravasación leucocitaria (29).
Una vez alcanzada la membrana basal, los leucocitos siguen el gradiente de Quimiokinas, libres o fijas a GAGs, hasta llegar al sitio inflamatorio que los convocara.
Las Quimiokinas exhiben un alto grado de variación en su afinidad por la heparina y otros Glucosaminoglicanos (GAGs). Por otra parte la concentración y tipo de GAGs, en la superficie de las células endoteliales, varía acorde con el tipo de lecho vascular donde se encuentran. Las células endoteliales demuestran flexibilidad respecto de la expresión del tipo de GAGs y estructura fina de sus cadenas de carbohidratos (30,31).
Variaciones en las secuencias de carbohidratos y el posicionamiento de los grupos con carga negativa y variaciones en la secuencia de AA en las diversas citokinas, contribuyen a la selectividad de las interacciones GAGs-Quimiokinas. Es posible entonces que estas diferencias estructurales en GAGs y Quimiokinas determinen sus niveles de afinidad y su selectividad hacia los tipos y subgrupos de leucocitos reclutados. Dichas especificidades podrían también influir en los gradientes de citokinas y ordenar el ritmo del tráfico leucocitario (32,33).
El antígeno Duffy, muy popular entre hemoterapeutas, fue originalmente descrito en eritrocitos y funciona como receptor de Quimiokinas (DARC) (34).
La sigla DARC surge de “Duffy Antigen Receptor for Chemokines. La migración transendotelial de Neutrófilos hacia sitios de inflamación depende de la interacción entre el receptor DARC y la Quimiokina CxC8 (35,36).
DARC es una proteína de 7 pases de membrana (7 regiones hidrofóbicas), no acoplada a “proteínas -G”, que se encuentra Eritrocitos, algunas Células Epiteliales, Células de Purkinje de Cerebelo, Células Endoteliales de Capilares Tiroideos y Células Endoteliales de Vénulas Post-Capilares de ciertos órganos y grandes vénulas pulmonares (37).
No ha sido detectado en endotelios arteriales o arteriolares. El Duffy es un receptor de Quimiokinas de amplia especificidad de unión para miembros de las familias CC y CxC excepto MIP-1, MIP-1β y XCL1. El DARC podría funcionar en los mecanismos de endocitosis y transcitosis de Quimiokinas, dado que se lo encuentra característicamente asociado a caveolas formadoras de vesículas de
transporte intracelular (38,39).
En el modelo de inflamación más probable, las Quimiokinas serían reconocidas por DARCs en caveolas y de esta manera podrían viajar hasta el lumen endotelial para ser derramadas sobre una superficie rica en GAGs. Los GAGs fijarían estas citokinas en los extremos de las proyecciones endoteliales y los presentarían a los leucocitos circulantes. El tipo de leucocito a ser transportado, siguiendo el gradiente de Quimiokinas, dependerá entonces del tipo de GAGs y del tipo de Quimiokinas involucradas en el proceso inflamatorio (40).
Defensinas
Las Defensinas son “Antibióticos Peptídicos” naturales que desempeñan importantes tareas en el campo de la inmunidad innata y se encuentran tanto en plantas como animales, desde insectos hasta humanos.
Las Defensinas de los mamíferos son moléculas básicas muy activas contra hongos, bacterias y virus, de pequeño tamaño (18-45 AA) y alta preservación evolutiva. Estas moléculas exhiben una estructura “hoja beta” en la que se reconocen 6 a 8 Cisteínas y dos o tres puentes disulfuro intramoleculares que
le confieren estabilidad. Su fuerte hidrofobicidad les permite infiltrar, instalar poros y permeabilizar membranas de agentes microbianos (41).
Los genes que codifican Defensinas son altamente polimórficos, sin embargo ciertos aspectos estructurales se encuentran altamente preservados.
En función de sus diferencias estructurales, en mamíferos se distinguen tres clases principales de Defensinas: Alfa (α), Beta (β) y Theta (θ).
Las alfa (α) Defensinas se encuentran predominantemente en neutrófilos, en sus equivalentes intestinales llamados Células de Paneth y en ciertas poblaciones de macrófagos.
Las beta (β) Defensinas se expresan preferentemente en leucocitos y células epitaliales.
A pesar de sus diferencias en secuencia de DNA y apareamiento de puentes disulfuro, las familias alfa y beta defensinas parecen haber evolucionado a partir de un gen pre-mamífero común bastante ancestral.
En humanos, la única versión disponible en Theta (θ) Defenisina o “Retrociclina”, son múltiples pseudogenes que poseen un Codon Stop que permite la transcripción a mRNA pero no su traducción a péptidos (41,42).
Las Defensinas se expresan de manera constitutiva y también en respuesta a productos microbianos o citokinas pro-inflamatorias. Algunas Defensinas inhiben la producción de corticoides por competencia con el receptor de corticotropina, por eso son también llamadas corticostatinas (43).
La topología polar de estas moléculas, con regiones hidrofóbicas de carga positiva separadas espacialmente, habilita su inserción en las membranas fosfolipídicas.
Dichas regiones catiónicas reaccionan con las cabezas aniónicas fosfolipídicas y dan lugar al agregado de otras Defensinas hasta formar poros tubulares o bien cubren la membrana microbiana y de esta manera facilitan su fagocitosis.
En virtud de su condición de lectinas las alfa Defensinas pueden suprimir la activación de la vía clásica del complemento por captación de C1q.
En definitiva, estas proteínas despliegan un amplio rango de efectos: promueven el reclutamiento de neutrófilos, estimulan la fagocitosis, suprimen mediadores anti-inflamatorios e incrementan la producción de citokinas pro-inflamatorias. En conjunto las Defensinas articulan mecanismos de defensa innata y recursos inflamatorios contra agentes microbianos.
El mecanismo de acción de las Defensinas no parece restringirse a acciones directas sobre membranas o envolturas de partículas virales. También pueden ejercer actividad antiviral mediante inhibición de ciertas rutas de señales, como aquellas vinculadas a la activación de la Proteína Kinasa C (44).
Alfa (α) Defensinas
En humanos fueron descritas hasta ahora seis alfa (α) Defensinas, caracterizadas como pequeños péptidos ricos en arginina que desempeñan importantes roles en diversos procesos relacionados con tareas defensivas anti-microbianas.
Son efectores y reguladores de inmunidad innata a la vez que estimuladores de respuestas inmunes adaptativas.
Las Defensinas alfa humanas fueron identificadas con la sigla HNP que surge de Human (H), Neutrphils(N), Peptide (P) o “Human Neutrophil-derived alpha-defensins”. Los Neutrófilos Humanos tienen grandes cantidades de Alfa Defensinas HNP-1/HPN-3 y también HPN-4 aunque en menor cantidad.
Las alfa Defensinas HD5 y HD6 se expresan mayormente en Células de Paneth, que constituyen el equivalente de los Neutrófilos a nivel del intestino delgado. Ver Inmunidad de Mucosas (45,46).
La activación de Receptores Citoplasmáticos de Peptidoglicanos como Nod2, induce la expresión intestinal de Alfa Defensinas y de hecho la Ileitis Regional de Crohn se vincula a mutaciones en este receptor (45,46,47).
Las Defensinas alfa de origen humano HNP3, HNP4, HD5 y HD6, adoptan conformación dimérica y comparten la misma estructura terciaria con alfa y beta Defensinas, pero guardan entre sí poca homología estructural.
Las alfa Defensinas HNP1-4 tienen similar actividad antimicrobiana y quimiotactica pero las alfa Defensinas intestinales carecen de actividad quimiotactica (47).
Las Defensinas de Neutrófilos HNP-1/HPN-3 poseen interesantes propiedades antivirales y antitoxicas. Las HNPs incrementan la fagocitosis de macrófagos en ratones, HNP1-3aumentan la producción de TNF e IL-1 y decrementan la expresión de IL-10 por los monocitos.
Las Defensinas-Alfa (α), se expresan en Neutrófilos, Macrófagos y Células de Paneth del Intestino, donde colaboran en el mantenimiento de un correcto balance microbiano. Sus genes codificantes son DEFA1- DEFA6.
Beta Defensinas (β)
Hasta mediados de la década del 90 sólo se conocían Beta Defensinas en gallinas y ganado bovino. En humanos se describió la primera de ellas en 1995 (hBD-1) y la segunda en 1997 (hBD-2). La sigla corresponde a “human Beta Defensin” y el número corresponde a cada versión descrita en humanos (42,48,49).
Las Defensinas Beta (β) tienen pequeño tamaño, alta densidad de carga catiónica (básica) y seis motivos Cisteína. Los genes de Defensinas Beta están conformados por dos Exones: el primero codifica la secuencia hidrofóbica líder y el segundo los péptidos ricos en Cisteínas. Las Defensinas-Beta (β) están ampliamente distribuidas y son segregadas por neutrófilos y diverso tipo de
Células Epiteliales. Se pueden encontrar en lengua, piel, córnea, glándulas salivares, riñón, esófago y tracto respiratorio.
Los Macrófagos y Monocitos no expresan Defensinas pero sí liberan mensajeros inductores de Beta Defensinas en Células Epiteliales.
El reconocimiento de Moléculas Asociadas a Patógenos (PAMPs) por Receptores Toll (like) induce en Células Epiteliales la liberación de Beta Defensinas.
Las hBD-1, hBD-2 y hBD3 despliegan fuerte actividad microbicida contra bacterias Gram-negativas como Pseudomonas Aeruginosa o Escherechia Coli y contra hongos como Candida Albicans y Malassezia Furfur. hBD-3 destruye además Gram-positivos como Streptococcus Pyogenes o Staphylococcus Aureus, incluyendo cepas multiresistentes de la misma estirpe o vancomicino-resistentes como Enterococcus Faecium. Se ha demostrado fuerte expresión de hBD-1 y hBD2 en
tejidos no-epiteliales como leucocitos, músculo cardíaco y esquelético (50).
Los Neutrófilos que tienen jerarquía de “fagocitos profesionales”, producen mayormente Defensina Beta y la empaquetan en sus gránulos azurófilos. El 30-50% de las proteínas acumuladas en dichos gránulos está constituido por Defensinas y el resto por otros agentes microbianos, elastasa y catepsina G (51).
La mayor parte de las Defensinas descritas en mamíferos son de familia Beta y están codificadas por una amplia gama de genes: DEFB1, DEFB4, DEFB103A, DEFB103B a DEFB107A/B, DEFB110 a DEFB133.
Las defensinas epteliales humanas hBD1, hBD2 y hBD3 se expresan en Piel de Humanos. Se ha establecido una clara asociación entre inflamación, producción de IL-1 y expresión de hBD-2.
La reacción PAMPs/TLRs descarga señales de activación al interior de los Neutrófilos, estos derraman el contenido de sus gránulos sobre la superficie de los microbios y ponen en marcha su maquinaria de fagocitosis (52,53).
Proyecciones farmacológicas en relación con HIV u otros virus
En el mono Macacus Rhesus se expresa el gen Theta-Defensina sin el mencionado Codon Stop del humano y su producto es un octadecapéptido cíclico catiónico (18 AA) llamado Theta (θ) Defensina (Retrociclina), de gran actividad antiviral, particularmente anti-HIV. La producción de theta-defensinas en el Macacus Rhesus involucra el ligado postraduccional de dos nonapéptidos, cada uno derivado de un precursor de 12 AA llamado “semidefensina”.
En humanos fue posible restaurar la expresión endógena de Retrociclinas con aminoglucósidos y esto abre la posibilidad de prevenir o tratar la infección por HIV mediante manipulación farmacológica de los mencionados pseudogenes Theta (θ) Defensina (54).
La Retrociclina-1 es un peptido sintético theta-defensina a partir de precursores codificados por pseudogenes theta-defensina humanos (θHD). La retrociclina-1 protege a linfocitos humanos de la infección con cepas R5 y X4 de HIV-1 y constituye un modelo para el diseño de novedosos agentes antivirales.
En suma, los productos de síntesis, que recibieron el nombre de Retrociclinas 1 y 2, pueden inhibir la replicación del Virus Thai HIV-1 (55).
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*capitulo extraído del libro: El Sistema Inmune: Genética, Biología Molecular, Clínica, Farmacología / Autores: Ricardo Antonio Giuliani y Eleno Martínez Aquino - 1a. Ed. - Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.
Eritroferon S.R.L., 2011.
ISBN 978-987-27121-0-5
