cap. 3. Señalizaciones

Autor:
Ricardo Antonio Giuliani

En su curso evolutivo la vida debió establecer límites precisos con el entorno (membrana)
y crear un compartimiento especializado para proteger su material genético (núcleo).
Pero todo organismo vivo necesita informarse permanentemente de las condiciones
ambientales, porque depende de nutrientes críticos y rangos térmicos muy ajustados.
Esto implicó el perfeccionamiento progresivo de los sistemas de transferencia de información
desde la membrana celular a las diversas estructuras intracelulares.
Con la aparición de organismos de mayor complejidad la transmisión de señales
fue adquiriendo niveles cada vez más sofisticados. Los Metazoarios utilizan receptores
transmembrana para señales que no pueden atravesar la membrana y receptores
intracelulares para ligantes liposolubles que sí pueden hacerlo (p. ej. esteroides).
La reacción entre los mencionados receptores y sus ligantes activa en cascada
una serie de interacciones enzimáticas y ensambles moleculares que funcionan de
manera parecida a un conmutador telefónico.
Dichos eventos corporizan señales que culminan en apertura de canales de calcio,
activación de actomiosina, transcripción genética y muchos otros fenómenos de
vital importancia celular.
Las moléculas que participan en estos procesos utilizan secuencias, motivos o
dominios específicos para interacción modular con secuencias afines, expresadas en
determinadas proteínas, lípidos o carbohidratos.
La vida diseñó diversos modelos de transmisión de señales, pero uno de los
más ingeniosos, por su economía y eficiencia, se basa en la inducción de cambios
conformacionales por adición o sustracción de grupos fosfato.

Kinasas y Fosfatasas
Las Kinasas son enzimas que transfieren grupos fosfato desde donantes de alta energía (ATP) a substratos específicos (fosforilación). Las Tirosin Kinasas fosforilan aminoácidos (AA) Tirosina y las Serin Treonin Kinasas AA Serina y Treonina.
La adición de fosfato casi siempre provoca cambios estéricos inductores de movimiento y de allí el nombre de las enzimas que realizan esta tarea (Kinasas), pero a veces ocurre lo contrario y la adición de fosfato provoca inhibición. Con las Fosfatasas ocurre algo parecido, porque la sustracción de fosfato suele tener efecto inhibitorio, pero algunas fosfotirosinas bloquean sitios enzimáticos y su desfosforilación resulta en activación.
El descubrimiento de la v-Src Kinasa del Sarcoma Aviario de Rous y su contrapartida normal la c-Src Kinasa abrieron el fascinante capítulo de las Señalizaciones Intracelulares (1).

Receptores Tirosin Kinasa (RTKs)
Hay receptores monoméricos que poseen actividad de Tirosin Kinasa en su cola citoplasmática y afinidad por ligantes específicos en su larga proyección aminoterminal extracelular. Muchas citokinas, factores de crecimiento y hormonas utilizan este tipo de receptor (RTK) para enviar señales al interior de la célula. La reacción entre el RTK y su ligante específico induce la dimerización y autofosforilación de múltiples residuos tirosina (p-Tyr) en su cola citoplasmática. Las proteínas citosólicas que contienen motivos SH2 y PTB son atraídas a la membrana y amarradas a los p-Tyr de
RTKs dimerizados. Este ensamble de proteínas citosólicas a nivel de membrana, aproxima Tirosin Kinasas a substratos específicos e induce ulteriores cascadas de fosforilación, que conducen a la habilitación de diversas funciones celulares (2).

Proto-Oncogenes, Oncogenes y motivos SH2 - SH3
El Proto-Oncogen c-Src y sus módulos SH2 y SH3 desempeñan tareas críticas
para el ensamble de moléculas de señalización y constituye un modelo paradigmático
para la comprensión de este campo de la biología (3).
Francis Rous descubrió en 1911 que era posible desarrollar sarcomas en gallinas
mediante inoculación de un virus aviario. Posteriormente se observó que
solo uno de los cuatro genes de este virus provocaba Sarcoma (Scr). Por eso, al gen
“transformador” u “oncogen” se le denominó v-Src.
Luego se demostró que sólo algunas cepas del virus poseen dicho gen y que
las gallinas normales tienen un gen muy parecido que no ocasiona transformación
maligna. A la versión no viral ni tumoral de este gen se le denominó c-Src.
El producto del gen v-Src es una proteína que posee actividad constitutiva
de Tirosin Kinasa (TK), debido a la carencia de una P-Tyr inhibitoria Carboxiterminal
(p-Tyr 527).
En su versión “silvestre” o normal (c-Src) la p-Tyr 527 reacciona con un motivo
interior SH2 de la molécula y oculta por plegamiento el sitio activo Tirosin Kinasa (4).
Cuando se reunió toda esta información comenzó a entenderse mejor la historia
natural de la actividad oncogénica del virus de Rous. Luego de múltiples
ingresos y egresos este virus arrastró consigo al gen c-Scr y a partir de aquí quedó
como Scr viral (v-Scr). En su curso evolutivo el gen v-Scr terminó perdiendo la
región que codifica la Tirosina de posición 527, que es la que se encarga de ocultar
la función Kinasa de esta proteína. A raíz de esto su producto proteico comenzó a
funcionar como Kinasa constitutivemente activada, no modulable (3).
De aquí surgieron los conceptos “transformación”, “onco-gen” y “proto-oncogen”
tan utilizados en hematología.
La proteína v-Src carece de p-Tyr 527, no puede reaccionar con el SH2 de su
interior y su actividad de TK no puede ser modulada. Por deleción de un módulo
regulatorio tan importante, su actividad de TK no puede detenerse e induce proliferación
celular desmesurada. En estas condiciones los controles del ciclo celular
pierden eficacia y dejan pasar aberraciones genéticas que contribuyen al desarrollo
oncológico. El Sarcoma Aviario de Rous y las enfermedades mieloproliferativas del
humano comparten mecanismos oncogénicos similares (5).
Siguiendo esta línea de ideas se descubrió que muchos otros genes, codificantes
de proteínas con actividad de Tirosin Kinasa, Fosfatasa u otras enzimas, podían
perder regiones moduladoras por deleciones, mutaciones espontáneas o virus.
Fueron llamados “proto-oncogenes” aquellos genes que podían ser “transformados”
en oncogenes al perder regiones críticas para su modulación funcional. Los
trabajos iniciados por Payton Rous en 1911 culminaron casi cien años después en el
desarrollo de inhibidores específicos de TK como Imatinib, Nilotinib o Dazatinib.
Con este recurso terapéutico se puede hoy lograr la “curación funcional” de la mayoría
de los enfermos que padecen Leucemia Mieloide Crónica. Recientemente se ha demostrado
también la eficacia de inhibidores de JAK2 en Mielofibrosis (6,7).

Motivos SH2 / SH3
El producto de la versión no oncogénica del gen v-Src, es decir c-Src, tiene un dominio
SH3 aminoterminal, un dominio SH2 central y un dominio TK. Los sitios
SH2 y SH3 cooperan en la autoinhibición del dominio Kinasa.
SH significa “motivo” Homólogo o similar a la secuencia descrita en v-Src (8).
La fosforilación de la Tirosina 527 (p-Tyr 527) atrae al motivo SH2 intramolecular
e induce un plegamiento de la proteína. Por otra parte dicho cambio espacial facilita
la reacción entre SH3 y un Motivo Rico en Prolinas (MRP) ubicado en el puente
que une p-Tyr 527 con SH2. De esta manera el sitio activo TK queda bloqueado.
La actividad enzimática de c-Src puede recuperarse mediante remoción del Fósforo
de p-Tyr 527 o mediante la unión de SH2 a una Fosfo Tirosina competitiva (9).
Resumiendo: SH2 es un motivo afín a Fosfotirosinas (p-Tyr) y SH3 un motivo
afín a Motivos Ricos en Prolina (MRP) y la H en ambos indica que se trata de
estructuras homólogas (similares) a la TK originalmente descrita en el virus del
linfoma aviarios (v-Src).
La Tirosin Kinasa se expresa cuando la molécula está en conformación “abierta” y la Tirosina (Y) del sitio activo fosforilada. La actividad enzimática se extingue en la forma “cerrada”. En este caso la Tirosina (Y) carboxiterminal fosforilada atrae a SH2 y oculta e impide la fosforilación de sitio activo.
A partir de estas observaciones comenzó a desarrollarse el extenso capítulo sobre
“módulos” de interacción molecular. Las proteínas que intervienen en las tareas
de transferencia de información, utilizan secuencias específicas para interacción
modular con otras proteínas, carbohidratos o lípidos.
Los trabajos seminales sobre v-Src y c-Src demostraron que el dominio SH2
es crítico para que la TK c-Src pueda ligarse a una p-Tyr de otra o incluso de la
misma proteína y la secuencia SH3 es necesaria a la vez para ligar Motivos Ricos
en Prolina (MRP) sobre otra o la misma proteína. Por otra parte la deleción de los
motivos SH2 y SH3 en una RTK, anula por completo su función, aunque el sitio
enzimático activo esté preservado (10,11).
La vida probó diversos módulos de interacción molecular y “conservó” los más eficaces
para cada función. Para adaptarse a las cambiantes exigencias del medio ambiente
debió desarrollar organismos cada vez más complejos, pero siempre economizó y preservó
los recursos de mayor aptitud funcional. Los exones de genes que codifican “módulos”,
“motivos” o “dominios” similares fueron recibiendo el nombre de la proteína donde se los
describió originalmente. Ejemplos: SH por Src/Homólogo, PH por Plextrin/Homólogo,
etc. Los exones que codifican dichos módulos de interacción fueron incorporados, en
diferentes combinaciones, a genes de diversas proteínas de señales (12).
Además fueron sufriendo discretísimas modificaciones con el propósito de generar
atracciones intermoleculares de altísimo grado de especificidad, entre dos proteínas
o entre una proteína y módulos propios de carbohidratos o lípidos. Por ejemplo, la Kinasa
ZAP-70 tiene motivos SH2 en tandem diseñados para interacción específica con
los dos P-Tyr de los módulos ITAM de las cadenas Zeta del complejo TCR (13).
Otras proteínas de señales a veces combinan varios módulos de interacción de
diverso significado funcional. Es de esta manera que pueden armarse ensambles
moleculares específicos para la transmisión de señales puntuales.
Hay proteínas que carecen de sitios catalíticos y desempeñan tareas exclusivamente
adaptadoras dentro de los ensambles de señalización. Ejemplos de este tipo
son las proteínas MyD88, Grb2 y Shc (14).
Estas moléculas pueden tener un motivo SH2 para unirse al complejo P-Tyr
de una proteína y un módulo SH3 afín a Motivos Ricos en Prolina (MRP) de otra
proteína, que a su vez puede o no tener sitios catalíticos. De esta manera, utilizando
dominios interactivos bastante específicos, es posible el armado de complejos
moleculares aptos para la transmisión de señales. En el caso de los Receptores con
Función Tirosin Kinasa (RTK) la adición o sustracción de fósforo es la llave que
regula la potencia de las mencionadas interacciones (14).
El sitio activo de las RTK, que se encuentra en su cola citoplasmática, suele
estar oculto por algún tipo de plegamiento molecular, como ocurre en el caso de
los receptores de Citokinas (p.ej. PDGF-R). La reacción entre RTK y su ligante
específico, p.ej PDGF-R con PDGF, provoca la dimerización del receptor y la
autofosforilación de los segmentos inhibitorios. Una vez liberado, el sitio activo
TK fosforila a su vez sitios Tirosina no catalíticos de la misma proteína o de su
socio dimérico. De esta manera se generan lugares apropiados para el amarre de
proteínas portadoras de módulos SH2 (15,16,17).
En general los RTKs “activados” tienen propiedades oligoméricas y sus ligantes
pueden generar diversas combinaciones entre subunidades estrechamente relacionadas.
Así se abre la posibilidad de generar ensambles de señalización (“signalosomas”) de
diverso significado funcional, desde un mismo tipo de receptor. Un buen ejemplo es
el caso del PDGF-R y su ligante PDGF. PDGF resulta de la asociación covalente
entre dímeros A y B en diversas combinaciones y PDGF-R resulta de la asociación
de cadenas α y/o β también en diferentes combinaciones (18,19).
La formación del heterodímero PDGF-R α/β intensifica la señalización vía
Ras-MAPK, porque carece de afinidad por la GTPasa Ras, que es un modulador
de dicha cascada de fosforilaciones. Más adelante nos extenderemos en detalle
sobre esta y otras rutas de señalización. PDGF significa Factor de Crecimiento
Derivado de las Plaquetas (20).

SH2: estructura y función
Los motivos SH2 son secuencias de casi 100 AA que tienen afinidad por superficies ligantes muy específicas, compuestas de Fosfotirosinas (p-Tyr) instaladas en un contexto de 3 a 6 AA carboxiterminales. La atracción entre motivos SH2 y sus ligantes resulta de la singular compatibilidad entre la hidrofobicidad de los AA asociados a la p-Tyr y la secuencia de AA en cada versión de SH2. La adición de fósforo a la Tirosina (p-Tyr) de la superficie ligante brinda la potencia necesaria para el amarre de SH2 a su ligante (21,22,23).
Ergo, la habilidad de los RTK para estimular rutas de señales depende en cierta medida de las secuencias de sus sitios de fosforilación, dado que estas determinarán cuales proteínas portadoras de módulos SH2 serán atraídas hacia las colas citoplasmáticas del receptor. La atracción de SH2 por un sitio Tirosina no fosforilado no debe ser demasiado fuerte, de lo contrario la adición de fósforo no podría regular la reacción. Debe entonces existir compatibilidad en la secuencia de AA tanto
en SH2 como en la Superficie Ligante, es decir que ningún AA debe interferir el reconocimiento de la P-Tyr, de lo contrario la unión sería imposible (24,25).
Consistente con este concepto, los sitios SH2 de la Fosfolipasa C gamma 1 (PLC-γ1) pueden amarrarse a sitios (P-Tyr) pYXXM pero basta el cambio por S (Serina) de la M (Metionina) para que dicha unión se frustre. Esto demuestra que el simple cambio de un aminoácido (AA) puede modificar la especificidad de la reacción entre SH2 y su ligante (26).
Hasta ahora han sido reconocidos tres tipos básicos de formaciones SH2: PLC-γ1 símil, Src símil y Grb2 símil. Dichas variantes de SH2 pueden adoptar el fenotipo de alguna de las otras dos mediante la mutación de un AA singular y esta flexibilidad parece haber brindado importantes ventajas evolutivas, al facilitar el desarrollo de nuevas conexiones de señalización. La relevancia de las interacciones mediadas por específicos dominios SH2 ha podido verificarse experimentalmente, mediante la introducción de mutaciones en los sitios de amarre para módulos SH2 de ciertos receptores (25,27).
Por otra parte, cada sitio de fosforilación en un receptor tiene la potencialidad de ligar proteínas portadoras de módulos SH2 de manera secuencial y esto permite habilitar rutas bioquímicas específicas para cada función biológica.
Es importante remarcar que puede existir superposición de rutas de señales sobre determinados blancos funcionales, resultando esto en cierto grado de redundancia (2).

Motivos PTB
Hay módulos “de unión a fosfotirosinas” (PTB) que difieren estructural y funcionalmente de los motivos SH2. Los motivos PTB se ligan preferentemente a secuencias NPXY donde N es Asparagina, P Prolina, X cualquier AA e Y es Tirosina.
Adviértase la diferencia de ubicación de la Tirosina, que corresponde a la letra Y, entre las secuencias ligantes de PTB (NPXpY) y SH2 (pYXXM). Nótese además que los sitios NPXpY son de ubicación yuxtamembrana. Muchas proteínas utilizan módulos PTB para unirse a otras proteínas y no siempre las Tirosinas de sus ligantes NPXY o similares requieren de la adición de Fósforo (p) para alcanzar
suficiente poder de atracción (28, 29).
Hasta aquí hemos visto dos tipos diferentes de módulos que requieren la presencia de Tirosinas (Tyr o Y) en sus ligantes.
Reiteramos: una de las diferencias más importantes entre SH2 y PTB es que las Y de los ligantes de PTB pueden en algunos casos no requerir la adición de Fósforo para que la unión sea posible (30).
Hay duplas interactivas basadas en el reconocimiento de Serina y Treonina fosforiladas, condición que se logra mediante activación de Kinasas de Serina y Treonina, como las que intervienen en la ruta MAPK de señalización.
Los módulos SH2 constituyen el prototipo de una extensa y creciente familia de módulos de interacción aptos para el entramado de señalizaciones intracelulares (31).

Motivos SH3, EVH1, WW y otras duplas interactivas 
Otra familia de módulos de interacción se basa en la específica afinidad por motivos ricos en prolina (MRP) y de estos han sido descritos los motivos SH3, WW y EVH1, donde W es Triptofano, E es Glutamato, V es valina y H es Histidina.
Recordemos de todas maneras que en el caso del módulo SH3 la H significa “homología” y no Histidina (32,33).
Los dominios EH reconocen secuencias NPF, donde N es Asparagina (Asn), P Prolina (Pro) y F Fenilalanina (Phe). Las interacciones EH/NPF intervienen en el tráfico intracelular de proteínas (34,35).
Los dominios PDZ, es decir Prolina-Aspartato-Glutamina, ligan cortos motivos peptídicos en el extremo carboxilo de ciertos receptores transmembrana.
Dos motivos PDZ repetidos pueden promover la atracción entre proteínas portadoras de PDZ induciendo fenómenos de oligomerización (36,37).

Fosfo Inosítidos y Dominios FYVE, PH, PX, FERM
Muchos procesos celulares, incluyendo tráfico de vesículas, transducción de señales
y rearreglos del citoesqueleto, dependen del desplazamiento de proteínas
citosólicas a la membrana. La adherencia de una proteína a la membrana depende
de diversos tipos de interacciones moleculares y uno de los más importantes es
el reconocimiento de Fosfoinosítidos (PI) por determinados dominios proteicos.
Siete PI diferencialmente fosforilados son reconocidos por diversos módulos o
secuencias proteicas: C2, ENTH, FERM, FYVE, PH, PX, SH2, PDZ y PTB.
Todos ellos tienen afinidades estructurales y funcionales entre sí y habilitan la
conexión de fosfoinosítidos con diversas rutas de señalización.
La mayoría de estos módulos puede reaccionar contra varios PI diferentes,
pero el dominio FYVE despliega singular selectividad por PI fosforilados en
posición 3 del anillo inositol o sea Fosfatidil Inositol 3 Fosfato (P3P). Estos dominios
FYVE, además de ligarse a P3P, insertan también elementos hidrofóbicos
en la bicapa fosfolipídica de la membrana.
Por otra parte, el anclaje a la membrana de los diversos módulos mencionados puede acompañarse de interacciones con múltiples grupos lipídicos. Por ejemplo, el dominio PX puede ligarse de manera cooperativa a P3P y al Acido Fosfatídico.
El anillo Inositol puede ser fosforilado en tres posiciones (3, 4 y 5) y de las
combinaciones resultantes surgen varios tipos de PI. Algunos PI residen en microdominios
de membrana (rafts), otros pueden ser clivados y quedar en forma
soluble y todos pueden cambiar de una a otra versión acorde con los requerimientos
funcionales de la célula. Por eso resulta tan extensa la red de señalización
celular dependiente de Fosfo Inosítidos (PI).

Fosfatidil Inositol 3 kinasas (PI3K)
Es importante remarcar que para la inserción de un grupo fosfato, en cada una de
las posiciones de fosforilación del anillo inositol, se requiere una enzima específica.
La función puntual de fosforilar la posición 3’ del Anillo Inositol está a cargo de la
familia Fosfatidil Inositol 3 kinasa (PI3K) (38,39).
La adquisición de un grupo fosfato en posición 3’ convierte al PI en blanco de
atracción para moléculas que desempeñan tareas críticas en biología celular (40).
Por eso son tan importantes las Kinasas PI3K en biología de los metazoarios.
Esta familia de Kinasas se compone de Clases I, II y III. De estas, las únicas capacitadas
para convertir al Fosfatidil Inositol 4,5 (PI(4,5)P2 en PI(3,4,5) P3 son las PI3Ks
de Clase I. Este proceso se desarrolla en la cara interna de la membrana celular.
Las PI3Ks de Clase I son heterodímeros que resultan de la combinación de
dos subunidades, una es reguladora y la otra tiene función Kinasa. Hay varias cadenas
reguladoras y varias con actividad de Kinasa (catalítica). La función catalítica
está a cargo de dos versiones proteicas de pm 110 kDa: 110 α, 110 β y 110 δ. La
subunidad reguladora que se expresa con mayor frecuencia es la p85 α. La subunidad
catalítica que se expresa primariamente en leucocitos es la p110 δ y desempeña
tareas críticas para el Sistema Inmune Adaptativo. La subunidad reguladora p85
contiene dominios SH2 y SH3.
El producto de la actividad enzimática de las PI3Ks es la generación de inosítidos
fosforilados en posición 3´ del anillo inositol (PIP3) y esta modificación ejerce
fuerte atracción sobre proteínas portadoras de módulos o secuencias FYVE. Un
ejemplo es la proteína conocida como “antígeno 1 endosómico temprano” (EEA1),
que desempeña un rol crítico en biología de los liso y endosomas. La fuerte atracción
de FYVE por este tipo de lípidos (PIP3) se atribuye a secuencias ricas en Cisteína
ubicadas cerca del terminal carboxilo (38,41).
La mayoría de los módulos proteicos mencionados más arriba pueden interactuar
con diversos PI(s) pero los dominios FYVE son particularmente selectivos por P3P.
La estructura y especificidad del motivo FYVE está mejor preservada que
otros dominios de interacción con PI(s).
FYVE es un dominio de 65 AA, compuesto por 8 AA Cisteína-Histidina
espaciados de manera específica, cuya estructura está sujeta a coordinación por dos
átomos de Zinc. La afinidad de FYVE por grupos acídicos PIP3 depende de manera
crítica de la presencia de un AA básico adyacente a su 3er Cisteína (42).
El dominio FYVE ha sido descrito en al menos 37 proteínas y su nombre resulta
de la Sigla formada por la primera letra de cuatro de ellas: Fab1, Yglo23, Vps y Eea1.
Pero como decíamos, son varios los módulos que interactúan con PI fosforilados
en posición 3 del anillo inositol y entre ellos PX desempeña tareas de gran
importancia funcional.
PX es un dominio de 120 residuos que también ejerce gran afinidad por
PI(3,4,5)P3 y PI(3,4)P2. Su nombre es la sigla resultante de Phagocyte Oxidase
(PhoX), donde fue originalmente descrito. PhoX es un complejo enzimático crítico
para la actividad fagocítica de los Neutrófilos y destrucción de patógenos. La Enfermedad
Granulomatosa Crónica resulta precisamente del fracaso funcional del sistema
PhoX. Dos proteínas de este complejo multimérico tienen módulos PX y de ellos
depende la reacción con PI3P y PI(3,4)P2. Más de 50 proteínas utilizan dominios
PX para posicionarse en la membrana cerca de sus substratos específicos (43).
PH es el mejor caracterizado de los dominios de interacción con PI. Fue
descubierto en una proteína plaquetaria llamada Plextrina y de allí su nombre
“Plextrin Homology” (PH) (44).
El dominio PH es una secuencia de 120 residuos que integra la estructura de varios
cientos de proteínas humanas. La evolución ha jugado bastante con estas secuencias,
insertando entre sus pliegues incluso algunos tramos homólogos a Src (45).
Los dominios PH fueron adoptados por un amplio rango de estructuras proteicas
que intervienen en temas tan diversos como señalización, organización del
citoesqueleto, tráfico de membrana o transformación lipídica.
El dominio PH puede encontrarse en Proteín Kinasas, Factores de Intercambio
de Nucleótidos de Guanina (GEFs), Proteínas activadoras de Guanidin
Tri Fosfatasas (GAPs), Fosfolipasas y otras. Además entre los dominios PH se
han registrado afinidades específicas para determinado tipo de fosfoinosítidos:
PtdIns(4,5)P2, PtdIns(4)P, PtdIns(3,4,5)P3 y PtdIns(3,4)P2 (46).
Acorde con el consenso actual sólo una minoría de dominios PH puede unirse
con especificidad y fuerza a PI(s). La mayoría reacciona con diversos fosfolípidos
de manera débil y promiscua (46).
Actualmente, para estudiar la dinámica y organización espacial de las señales
mediadas por lípidos de inositol en una célula viva, se utilizan módulos proteicos
fusionados con “proteína fluorescente verde” (GFP) (47).
Mediante marcación con GFP se pudo observar que los dominios PH despliegan
diferente grado de afinidad por PtdIns(3,4,5)P3 y PtdIns(3,4)P2.
En los módulos PH se han registrado sutiles variaciones de afinidad por PI
y esta singularidad funcional, permitiría a los PI modular con mayor grado de
precisión la intensidad de sus diversas rutas de señalización (48).
Por cierto, el blanco más frecuente de un dominio PH es el PtdIns(3)P. De hecho este
lípido se une estrechamente a algunas proteínas portadoras de dominios PH, como sucede
con la enzima Btk (Bruton TK) de la familia Tec, el Factor Grp1 de intercambio de nucleótidos
de Guanina, varias proteínas activadoras de GTPasa y el adaptador DAPP1 (49).
Algunos dominios PH se unen a PI monofosforilados como PI3P y otros a
PI3, 5P2, lo cual permite extender significativamente la red de señalizaciones
dependiente de este tipo de dominio.
La concentración de cada PI en determinados compartimientos de membrana
puede fluctuar enormemente y sus consecuencias pueden ser de gran importancia
funcional. Como ejemplo citamos el caso de las interacciones entre la PLCδ y los
PI de membrana. Luego del acople de la PLCδ a la membrana, logrado por interacción
de su módulo PH con PI3P, su actividad catalítica provoca liberación de
PI3 incrementando su concentración soluble. El PI3 libre ocupa los dominios PH
de la PLCδ y desplaza esta enzima de su unión a la membrana.
A pesar de su diversidad en secuencia y plasticidad funcional, la estructura de los dominios
PH permaneció bastante bien preservada a lo largo de la evolución (50,51,52).
Los dominios Protein Tyrosin Binding (PTB) tienen notable parecido a los
dominios PH, se encuentran en proteínas adaptadoras como IRS-1 o Ehc y reaccionan
con secuencias tirosino fosforiladas de RTK (53).
Los dominios PTB no suelen estar sujetos a regulación mediada por fosfoinosítidos,
pero los motivos PTB del adaptador Dab1 tienen afinidad por
PtdIns(4,5) P2 (54).
Los dominios FERM derivan su nombre de Four.1, Ezrin, Radixin, Moesin,
que constituye una familia de proteínas responsables de la unión dinámica de la
actina a la membrana. Los dominios FERM se ubican cercanos al terminal amino
de estas proteínas y despliegan fuerte afinidad por PI(4,5)P2 (55,56).
Los dominios FERM tienen afinidad por secuencias citoplasmáticas de integrinas
y fosfoinosítidos (57,58).
Tan sólo hemos mencionado algunos de los dominios afines a diversas variantes
de PI. La asociación prolongada de ciertas proteínas a la membrana
suele requerir múltiples interacciones proteína-lípido y proteína-proteína. Por
otra parte, las diversas versiones de PI no resultan exclusivamente de la acción
de Kinasas que fosforilan, sino también de Fosfatasas que desfosforilan PI. De
esta manera es factible producir un tipo singular de PI, en un determinado
compartimiento y en un momento funcional apropiado, evitando la generación
de tipos no deseados de PI.

Múltiples Módulos de Señales
En muchos casos las proteínas de señales están armadas con múltiples módulos de diferentes afinidades, que permiten interacciones covalentes proteína-poteína y proteína-fosfolípido. La unión entre diversos dominios puede contribuir a diversas funciones. Dos dominios pueden adherirse a diferentes sitios sobre el mismo blanco, como ocurre con algunas proteínas que poseen SH2 en tandem, como ZAP70, incrementando así la afinidad y especificidad de la reacción. Por otra parte módulos espacialmente distantes entre sí pueden interactuar con socios diferentes. Esto ocurre en casos como el adaptador Grb2 que mediante sus motivos SH2 y SH3 puede conectar receptores activados a blancos ubicados corriente abajo. Además estos dominios modulares pueden involucrarse en complejas interacciones intramoleculares que regulan la actividad enzimática, como ocurre con las Kinasas Src mencionadas más arriba o las Tirosin Fosfatasas Shp2.

Receptores Serina / Treonina
A diferencia de los RTK y las Kinasas Src, los miembros de la familia de receptores
del Transforming Gowth Factor Beta (TGFβ-R) utilizan kinasas que fosforilan
AA Treonina y Serina. La llave en este tipo de señalizaciones es también la adición
o sustracción de fósforo.
Prácticamente todas las células del organismo producen TGFβ y poseen
receptores para este ligante. La citokina TGFβ ejerce efecto regulatorio sobre
proliferación y diferenciación celular, desarrollo embrionario, cicatrización de
heridas y angiogénesis (59).
Hay tres isoformas de TGFβ (TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3) y cada una de ellas está
codificada por un gen específico, que expresa TGFβ más un propéptido asociado. Dicho
propéptido es clivado pero permanece asociado al TGFβ mediante uniones no
covalentes. Luego TGFβ/propéptido es secretado a la matriz extracelular donde forma
complejo con una proteína ligante de TGFβ que le confiere carácter “latente”. En dicho
contexto TGFβ no puede unirse a su receptor. Las proteínas “latentes” son codificadas
por cuatro genes diferentes y su expresan tiene especificidad de tejidos (60,61).
La Trombospondina-1 libera al TGFβ de su complejo con proteína latente y
precursor y habilita su interacción con el receptor TGFβ-R. Este es un paso regulatorio
aparentemente crítico, dado que tanto el ligante TGFβ como su receptor
TGFβ-R están presentes en la mayoría de los tejidos. Las plaquetas constituyen
una excepción porque guardan TGFβ en gránulos intracelulares y su liberación
ocurre cuando son activadas (62).
Hay tres tipos de receptores de TGFβ: TGFβ-R tipos I, II y III. Los TGFβ-R
I y II se diferencian por su mapeo peptídico, tienen funciones directas de señalización,
despliegan alta afinidad por TGFβ-1 y baja afinidad por TGFβ-2. El
TGFβ-RIII no señaliza, es el más abundante y su tarea se restringe a la captación
y presentación de TGFβ a tipos I y II.
La citokina TGFβ puede unirse al receptor de transferencia TGFβ-RIII para
ser luego presentada al TGFβ-RII o puede unirse directamente a este último sin
mediación de TGFβ-RIII (63).
Los miembros de la superfamilia de citokinas TGFβ, superan extensamente a
las versiones homo y heterodiméricas de TGFβ-R de tipos I y II. Esto sugiere que
hay un alto grado de promiscuidad entre ligantes y receptores de TGFβ.
No obstante, las rutas de señales que pueden activarse desde TGFβ-R parecen
ser bastante simples. Los ligantes TGFβ se unen a los monómeros TGFβ-RII
induciendo su dimerización, esto favorece la integración de dos moléculas TGFβ-RI
y la formación de un tetrámero. En dicho contexto la Kinasa TGFβ-RII, que se
encuentra constitutivamente activada, fosforiliza y activa la Kinasa TGFβ-RI y
esta a su vez fosforila en Serinas C terminales a las proteínas Smad2 o Smad3 (59).
A estos monómeros se les llama “r” porque deben ser activadpos por el receptor.
Luego uno de ellos, Smad2 o Smad3 se une a Smad4 y forma el dímero SMADr/
SMAD4. Finalmente el dímero se traslada al núcleo y allí interactúa con otros
factores transcripcionales. Estos últimos regulan la transcripcion de genes respondedores
a TGFβ. Por otra parte, las proteínas Smad6 y Smad7, que carecen de
sitios fosforilables, interfieren con las funciones de la Kinasa TGFβ-RI y actúan
como moduladores de esta vía de señalización (64).
Pero a este aparentemente simple sistema de señales se le agregaron recientemente
factores con función de anclaje que ayudan al reclutamiento de Smads al
complejo receptor. Uno de los más caracterizados es la proteína Smad Anchor for
Receptor Activation o simplemente SARA. Esta molécula tiene un sitio de unión
a Smad (SBD) que interactúa con Smad2 y Smad3 y un sitio de interacción C
terminal de interacción con el complejo TGFβ/ TGFβ-R. En definitiva SARA es
un presentador de Smad para su fosforilación en el receptor.
Un dato muy interesante es que SARA tiene un dominio FYVE y mediante
este recurso puede ligarse a PI3P a nivel de membranas del compartimiento
endosomal. Las mutaciones de SARA carentes de dominio FYVE impiden su
localización endosomal e interrumpe las respuestas transcripcionales resultantes
del acople TGFβ/ TGFβ-R (65,66,67).
Otra versión de receptor de TGFβ es la “Endoglina”, muy abundante en
células endoteliales, que tiene región Trans Membrana (TM) y cola citoplasmática
homólogas al TGFβ-RIII. Esta versión de receptor de TGFβ se encuentra mutado
en la Telangiectasia Hereditaria Hemorrágica (68,60).

Receptores de Interferon y ruta Jak-STAT
Los Interferones (IFN) Tipo I tales como IFN-alfa y beta, señalizan a través de
receptores que carecen de actividad catalítica propia (IFNR). Estos funcionan acoplados
a tirosin kinasas Janus ( Jak) y utilizan intermediarios transcripcionales
directos llamados STAT. La sigla STAT describe la función de estas proteínas, que
son a la vez transmisores de señales y activadores de transcripción genética.
La interacción IFN/INFR provoca dimerización del receptor y aproximación
de Kiansas Jak, estas fosforilan tirosinas e inducen dimerización entre STAT1 y
STAT2. Luego el dímero STAT interactúa con un tercer regulador transcripcional
conocido como IFN regulatory factor (9 IRF9) formando un complejo que estimula
la expresión de genes vinculados a IFN (69, 70, 71).
El capítulo de las Citokinas se inició precisamente con el descubrimiento de
los interferones antivirales (IFNα y β) y luego se agregaron varios más a la lista,
entre otros el IFNγ, una de las Linfokinas liberadas por Células Th1 (72).
Su nombre surgió hace cincuenta años cuando se identificó al IFN como
factor de “interferencia” en replicación viral (73).
Janus era el dios romano de doble cara ubicado en las puertas de entrada y
salida de los edificios, de allí January (enero) señalando al mes que da comienzo al
año, mirando simultáneamente al futuro y al pasado (74).
Janus designa también a las Kinasas asociadas a receptores de IFN (IFNR),
responsables de las fosforilaciones sobre residuos tirosina ubicados en las colas
citoplasmáticas de los receptores IFNR y en las proteínas STAT, adheridas a estos
mediante dominios SH2 (75).
Aparentemente las proteínas STAT precedieron a las moléculas Jak en el curso
evolutivo. Las Kinasas Jak aparecen en animales superiores casi simultáneamente con
el desarrollo del sistema inmune adaptativo. Esto es coherente con los múltiples roles
de las moléculas Jak en células inmunes. Presuntamente los receptores de citokinas
reclutaron la ruta STAT para asignarla mayormente a tareas de defensa (75).
Las Kinasas Jak son proteínas de más de 1100 AA y tienen un peso molecular
de 120 a 140 kDa. En su estructura se reconocen siete dominios homólogos
(JH). Entre ellos se destaca JH1, tiene función kinasa y características
estrechamente relacionadas con dominios Kinasa de receptores de la familia
Epidermal Growth Factor (76).
Adyacente a JH1 se encuentra un dominio pseudocatalítico o Simil Kinasa
JH2. Se trata de dos dominios estructuralmente similares, uno catalítico (JH1) y
otro sin función aparente (JH2). Esta disposición en tandem evoca las dos caras
del dios romano Janus y de alli el nombre de estas kinasas.
A pesar de no tener actividad enzimática JH2 desempeña tareas regulatorias
esenciales, porque su ablación suprime la función Kinasa de JH1.
Acorde con el modelo funcional más probable, el dominio pseudokinasa JH2
regula mediante interacción intramolecular la actividad catalítica y autofosforilación
de la kinasa Jak3 (77).
La falta de expresión del gen JAK3 resulta en Inmunodeficiencia Severa Combinada
(SCID), pero también puede ocurrir este síndrome por mutación que afecte el
dominio JH2. En este caso se expresa Jak3 carente de actividad enzimática (78).
La reacción ligante-receptor promovería un cambio conformacional en el receptor,
que induciría interacción recíproca entre kinasas Jak yuxtapuestas y fosforilación
de residuos tirosina en el loop activador de sus dominios Kinasa (79).
Las Kinasas Jak1, Jak2 Tyk2 se encuentran ampliamente expresadas en mamíferos.
Por el contrario Jak3 permanece restringida mayoritariamente a células hematopoyéticas
y fuertemente regulada durante el desarrollo y activación celular (80).
Las proteínas Jak aparecen habitualmente en íntima asociación con receptores
de citokinas a nivel de endosomas o membrana plasmática (81).
La ruta Jak-STAT interviene también en la regulación de respuestas celulares
vinculadas a otras Citokinas y Factores de Crecimiento. Las proteínas
STAT se adhieren a IFNR mediante módulos SH2, allí son fosforiladas en
residuos tirosina (p-Tyr), dimerizan por interacción SH2/p-Tyr, son liberadas
del receptor y transferidas al núcleo.
Mediante vías Jak-STAT se transmiten señales de proliferación, diferenciación
y apoptosis, de gran importancia en Hematopoyesis (82,75).
Las proteínas STAT pueden ser también activadas de manera directa por RTK
como Receptores Epidermal Growth Factor (EGFR) o Tirosin Kinasas No Receptoras
de la familia c-Src (83).
Esta ruta de señalización está sometida a regulación en diversos niveles. Por
un lado las Fosfatasas de Tirosina pueden remover fosfatos de los IFNR y de las
proteínas STAT (84).
Por otra parte las proteínas SOCS suprimen (S) señales (S) emitidas por citokinas
(C) mediante el bloqueo de la fosforilación de STATs por ocupación de sus
sitios de unión en los IFNR (85,86).
Además, a nivel del núcleo los dímeros STAT son inhibidos por los PIAS que
son proteínas (P) inhibidoras (I) de STATs (S) activados (A). Los PIAS interfieren
con los sitios/secuencias de DNA reconocibles por STATs (87).
Como vemos las moléculas STATs se parecen bastante a las proteínas SMAD
que intervienen en señalizaciones emitidas desde TGFRs.

Familia del Factor de Necrosis Tumoral
Esta es una extensa familia de receptores y ligantes estructuralmente relacionados
con la citokina llamada Factor de Necrosis Tumoral. Entre los receptores
se destacan TNF-R son CD30, 4-1BB, CD27, Fas y OX40 y entre sus ligantes
TNFa, TNFb, CD30L, CD40L, 4-1BBL y FasL.
Es importante remarcar que el receptor TNFR carece de actividad enzimática
en sus colas citoplasmáticas y que sus señalizaciones dependen enteramente de
interacciones proteína-proteína.
Para activar sus cascadas de señalización, la reacción entre ligantes y receptores
de la familia TNF articula un sistema de dominios modulares porteína-proteína
que no se apoya en adición/sustracción de fósforo.

Ligantes (TNF) y Receptores (TNFR)
Dominios Muerte (DD/Death Domains)

La citokina TNF desempeña tareas críticas en respuestas inmune e inflamatoria y
ocupa un rol central en shock endotóxico. Su infusión endovenosa puede provocar
fiebre, inducir expresión endotelial de Factor Tisular, activación de coagulación y neutrófilos,
liberación de otras citokinas y colapso cardiovascular. A concentraciones más
bajas puede ocasionar fiebre, anemia, resorción ósea, caquexia e inflamación (88,89).
TNFα es un importante regulador del sistema inmune y de hecho se han diseñado
exitosas drogas para el tratamiento de enfermedades autoinmunes, basadas
precisamente en la inhibición de esta citokina (90-93).
TNF es miembro de una familia de al menos diez citokinas, de las cuales
sóloTNF y LT son segregadas de manera parcial o total. El resto no suele desprenderse
de la membrana y por lo general reacciona con sus receptores en contextos
interactivos célula-célula (94-96).
Todos los miembros de la familia de receptores TNF (TNF-R), comparten
subunidades transmembrana idénticas y a lo largo de sus proyecciones extracelulares
repiten entre tres y seis motivos ricos en Cisteína. Por otra parte, en
sus colas citoplasmáticas los TNF-R y Fas-R presentan secuencias constituidas
por 60 AA, conocidas como “dominios muerte” (DD) por intervenir en la activación
de señales apoptoicas (97,98).
Los cDNA que codifican TNF y LT son muy parecidos y de hecho TNF puede
desplazar a LT de su receptor. Precisamente por tratarse de moléculas similares
fueron re-denomianadas TNFα (TNF) y TNFβ (Linfotoxina β) (99).
TNF es también conocido como “caquectina”, porque administrado en forma
crónica induce caquexia. Los tumores malignos y los fenómenos inflamatorios
crónicos suelen liberar grandes cantidades de TNF, este bloquea la expresión de
Lipoproteinlipasa y el ingreso de ácidos grasos a la célula (100-103).
Salvo TNFβ (LTβ), que está constituida de una cadena LTα y dos cadenas
LTβ, el resto de los ligantes de la familia TNF están integrados por tres subunidades
idénticas entre sí (104-107).
LTα es producida exclusivamente por Linfocitos y NKs y TNF predominantemente
por Macrófagos. La deleción del gen que codifica LTα, acompañada o no
de deleción de TNF, inhibe el desarrollo de las Placas de Peyer y la Pulpa Blanca
del Bazo sin afectar la integridad del Timo (106,107,108).
TNFα tiene 212 AA y es una proteína transmembrana arreglada bajo la forma
de homotrímeros estables. La metaloproteasa ADAM17 libera una versión soluble
de 51 kDa, que conserva su actividad biológica mientras preserve el arreglo homotrimérico.
A concentraciones inferiores al rango nanomolar el trímero TNFα
soluble se disocia y pierde actividad (109,110).
La citokina TNF puede unirse a dos tipos de receptores (TNF- R), identificados
bajo cluster of differentiation CD 120a/TNF-R1 (55/60 kDa) y CD 120b/
TNF-R2 (75/80 kDa). TNF-R1 se expresa de manera constitutiva en casi todos
los tejidos y puede ser activado tanto por TNF soluble como ligado a membranas.
TNF-R2 se expresa solamente en células del sistema inmune y solo responde a
TNF ligado a membranas (111,112).
Una vez que toman contacto con sus ligantes los TNF-R también forman
trímeros, ubicando sus extremos en el hueco que forma el trímero TNF. A los
TNF-R se les conoce también como receptores muerte, porque pueden activar
mecanismos de muerte celular programada o apoptoica. Característicamente
tienen un dominio llamado muerte, que se repite de manera bastante preservada
en todos los receptores de esta familia de ligantes. La sigla DD viene del
inglés Death Domain (113,114).
A pesar de la presencia de dominios muerte (DD) en su cola citoplasmática,
el rol en apoptosis de los TNF-R1/2 no parece ser tan relevante. Es mucho más
importante su influencia en la regulación de la respuesta inflamatoria vía NFkB y
en señalizaciónes mediadas por la vía MAPK (115,116,117).
La activación del TNF-R desbloquea su DD y este atrae al adaptador TRADD
que es también portador de motivos DD. Desde esta posición en la membrana
TRADD recluta a la proteína TRAF2 y a la Serin Treonin Kinasa RIP. Luego
TRAF2 amarra al complejo Kinasa IKK y este es activado por fosforilaciones
inducidas por RIP en residuos Serina (118,119,120,116).
En estado de reposo IKK forma complejo con el heterodímero NFkB e impide su
desplazamiento al núcleo mediante el bloqueo de su señal de loclización nuclear (121).
Una vez activado, el complejo Kinasa IKK fosforila e induce la degradación de
IKK liberando el acceso de NFkB al núcleo. De esta manera habilita la expresión
de numerosas proteínas involucradas en sobrevida y proliferación celular, respuesta
inflamatoria e inhibición de apoptosis (117).

CD40 y su ligante CD40L (CD154)
Como mencionáramos más arriba las proteínas CD40 y CD40L son también miembros de la familia TNF. La activación de CD40 resulta en una variedad de respuestas inflamatorias e inmunes, que incluyen cambio de clase de inmunoglobulinas, desarrollo de células B memoria y formación de Centros Germinales.
La proteína CD40 es un receptor de membrana que ocupa un rol central en la
activación de células inmunes y vasculares. CD40 es un mediador esencial para el
camibio de clase de inmunoglobulinas a cargo de células B.
También constituye un eslabón crítico en la activación de células presentadoras
de antígenos: macrófagos, células dendríticas y células B. Se expresa en diverso tipo
de células humanas incluyendo fibroblástos, células epiteliales y endoteliales.
La interacción con su ligante CD40L es crítica para la activación de estas células.
La reacción CD40L/CD40 induce en células endoteliales la expresión de
moléculas adhesivas, citokinas, quimiokinas y mediadores inflamatorios (122).
Las Plaquetas activadas exponen CD40L (CD154), este reacciona con el CD40
de las células Endoteliales y provoca en ellas reacción inflamatoria (123).
Las células Th1 activan el efecto antimicrobiano de los macrófagos. Dicho efecto
depende más de liberación de substancias citotóxicas que de fagocitosis, porque muchas
veces el agente a fagocitar es de mayor tamaño que el macrófago. La activación de macrófagos
debe estar sujeta a estricta regulación porque el Oxido Nítrico (NO) y los radicales
libres de oxígeno, pueden ocasionar daño a las células del propio huésped (124).
Los macrófagos advierten la presencia de “patrones moleculares asociados a patógenos”
(PAMPs) mediante Receptores Toll “Like” (TLR) y cuando esto ocurre, activan la
expresión de moléculas tipo II de MHC (MHC-II), cargadas con fragmentos de dichos
PAMPs. Además liberan IL-12, citokina que promueve la transformación de Células
CD4+ Naif a fenotipo Th1. El receptor T (TCR) detecta antígeno en MHC-II y reacciona
liberando Interferon gamma (IFNγ) y TNFα, citokinas que instrumentan la 1era señal
de activación del macrófago. Luego las Th1 expresan CD40L y este reacciona con CD40
en la superficie del Macrófago, habilitando la 2da señal de activación del Macrófago.
Gran parte de la función antimicrobiana de los macrófagos activados depende
de la producción de NO y radicales libres de oxígeno (ROS) (124).
Con su activación los macrófagos incrementan la expresión de MHC-II, CD80/
CD81 (B71/2), CD40 y receptores TNFα. Las citokinas TNFα e IFNγ ejercen efecto
sinérgico sobre macrófagos y contribuyen a amplificar la respuesta inmune (125).
Las células Th1 regulan cuidadosamente la activación de macrófagos para limitar
la liberación de substancias tóxicas, a lo estrictamente necesario para destruir
al patógeno. De esta manera evitan que potenciales excesos puedan afectar tejidos
sanos del huésped comprometido.
CD40 es una proteína integral de membrana, pesa 45 kDa y tiene cuatro dominios
extracelulares ricos en cisteína. Estos dominios tienen 45 AA de extensión
y constituyen una estructura típica de la familia TNF (126).
Es de expresión ubicua y se encuentra en Células dendríticas, Células B,
Monocitos/Macrófagos, Células T activadas CD4+ y CD8+, Epitelio Tímico, Endotrelio
Vascular, Keratinocitos y Firoblastos (127,128,129).
Mediante interacciones proteína-proteína y desde su cola citoplasmática,
CD40 se relaciona con diversas moléculas de señales. Entre ellas TRAF (factor
asociado al receptor TNF) que conecta estos eventos de membrana con señales de
activación por rutas NK-kB y NF-AT (130).
CD40L o CD154 también es una proteína integral de membrana, tiene 39
kDa, se registra en Eosinófilos, Mastocitos, Basófilos, Células NK, Células Dendríticas,
Linfocitos T CD4 activados, CD8 y otras (129,127,131).
Desde el punto de vista estructural CD40L forma un trímero y CD40 se liga
al mismo en la interfase entre dos monómeros. Las interacciones CD40/CD40L
son críticas para la regulación de numerosos procesos de activación del sistema
inmune: generación y mantenimiento de centros germinales, desarrollo de células B
memoria, etc (130,132,133).
El factor transcripcional AKNA coordinaría la expresión de este receptor
y su ligante (134).
Durante la inflamación TNFα y CD40 interactúan de manera significativa.
La ocupación del receptor CD40 por CD40L incrementa la producción de TNFα
y este a su vez incrementa la expresión de CD40 y potencia sus señalizaciones
intracelulares (135,136).
Las rutas de señalización desde CD40 han sido extensamente estudiadas en
Células B y se inician básicamente con el reclutamiento de TRAF a sus dominios
citoplasmáticos. En los estudios realizados en moncitos humanos se demostró que
la ocupación del CD40 con CD40L provoca un fuerte incremento en mRNA de
TRAF1, rápida aunque transitoria activación de las Kinasas ERK 1 y 2 e incremento
de TNFα, IL-6 e IL-8 (137).
La Células T Helpers Th2 también expresan CD40L cuando reconocen
el Antígeno presentado por las Células B. La reacción CD40l/CD40 induce
en célula B aumento en la expresión de MHC-II, cambio de clase de cadena
pesada de Ig, etc.
Por otra parte la activación del CD40 en Células B o Dendríticas promueve la
expresión de CD80 y este activa al receptor CD28 que es una molécula de Coactivación
en Células T.
La activación de CD28 por interacción con CD 80/CD86 resulta en incremento
de la expresión de CD40L, aumento de la secreción de IL-4 e incremento
en la producción de anticuerpos por parte de la célula B (138,139,140).
Por otra parte las Células Th2 expresan IL-4 que se une a receptores
IL-4R en Célula B. IL-4R es un heterodímero compuesto por una cadena γ
comun y una cadena IL-4Rα.
La reacción IL-4/IL4-R induce en Célula B respuestas más rápidas al estímulo
antigénico sobre el BCR. El estímulo de la Célula B mediante interacciones
IL-4/IL-4R y CD40/CD40L abre rutas alternativas a las señalizaciones que se
emiten desde el BCR.
Como resultado de estas interacciones las Células B pueden proliferar, cambiar de clase de cadenas pesadas de inmunoglobulinas y diferenciarse a Plasmocitos.
Las mutaciones que afectan al CD40L, otro miembro de la familia TNF, bloquean
el cambio de clase de Cadenas Pesadas de Igs y provocan en humanos un Síndrome de
Inmunodeficiencia ligado a Cromosoma X, caracterizado por niveles altos de IgM y
bajos o nulos del resto de las Igs (Síndrome de Hiper-IgM) (141,142,143).
Los macrófagos reciben de los CD4 (Th1) una primer señal mediada por IFN-γ
y una segunda señal mediada por CD40L. Los macrófagos expresan receptor CD40
de manera constitutiva y este reacciona con CD40L en cuanto aparece en la superficie
de las Células Th1. La activación de CD40 incrementa la expresión de CD40 y
TNF-R en la superficie de los macrófagos. Todo esto contribuye a aumentar su nivel
de activación con más fagocitosis de bacterias y producción de citokinas (144).
Fas / Fas-L
Fas ligante (Fas L) es una proteína transmembrana de tipo II, homotrimérica, que
también pertenece a la familia del Factor de Necrosis Tumoral. La reacción con su
receptor (Fas) activa señalizaciones de apoptosis o muerte celular programada y
desempeña tareas relevantes en inmunidad (145,146,147).
FasL se expresa en células activadas del sistema inmune, en células de tejidos
con “privilegio inmune” como testículos, ojos, cerebro, placenta y también en una
variedad de células tumorales (148).
La metaloproteasa zinc dependiente MMP-7 secciona a Fas en un sitio
de corte altamente preservado, liberando su proyección extracelular como
versión soluble. Pero el Fas L soluble no induce trimerización de Fas ni formación
DISC, aspectos críticos para la inducción de una poderosa respuesta
apoptoica (149,150,151) .
Se han descrito hasta ocho isoformas de Fas resultantes de splicing alternativo
de su RNA primario. La isoforma 1 es la que induce apoptosis con mayor potencia. La
molécula está compuesta de tres repeticiones ricas en cisteína, un dominio transmembrana
y una proyección intracelular con dominio DD (152).
El Fas L induce la formación del Complejo Inductor de Señales de Muerte
(DISC). La presencia del trímero Fas L en la superficie de una célula adyacente
provoca la trimerización del Fas (153).
Una vez conformado un trímero de motivos DD en la cara interna de la
membrana, el complejo es internalizado por endocitosis y esto permite la aproximación
de las proteínas adaptadoras FADD (Fas Adaptor Death Domain).
FADD tiene también DD, pero este en su terminal amino y Fas en su terminal
carboxilo. FADD tiene además un dominio llamado DED (Death Effector
Domain) y este reacciona con un dominio similar ubicado en la Procaspasa 8.
Estas últimas se superponen y mediante actividad proteolítica generan Caspasa 8
(activada) y esta es liberada del ensamble DISC. Luego Caspasa 8 puede activar
Caspasa 3 de manera directa o vía permeabilización mitocondrial mediada por
activación de tBid y liberación de citocromo C, un agente proapoptoico y Smac-
Diablo, un antagonista de inhibidores de apoptosis. Estos inducen la activación
de Caspasa 9 y esta a su vez activa también a Caspasa 3 (154).
Las señalizaciones de apoptosis mediadas por FasL/Fas desempeñan tareas
importantes en regulación del Sistema Inmune. Por otra parte las mutaciones en
genes Fas y FasL han resultado en fenómenos autoinmunes en diversos modelos
murinos (155,156,157).
Por otra parte en humanos las mutaciones en el gen Fas también pueden provocar
un síndrome linfoproliferativo familiar autoinmune. Además, en humanos
fue posible demostrar una mutación en el gen FasL de un paciente con Lupus
Eritematoso Diseminado (158).
Las Células T resisten las señales de apoptosis vía FasL/Fas durante su etapa
de expansión clonal, pero se sensibilizan a ellas a medida que transcurre la respuesta
inmune. La apoptosis es un recurso de primer orden para evitar fenómenos de
hiper-reactividad inmune.
Los linfocitos CD8+ atacan a sus células blanco mediante liberación de perforinas
e inducción de apoptosis vía FasL/Fas. Las perforinas son proteínas muy
parecidas al Factor 9 del Complemento y perforan la membrana con estructuras
tubulares similares al complejo de ataque de membrana.

APOPTOSIS
La palabra griega apoptosis fue introducida en la década de 1970, para describir
un proceso de muerte celular muy ordenado y diferente del ruidoso fenómeno de
la necrosis. Observando tejido hepático se veía que las células que morían se desprendían
encogidas y marchitas, como hojas de otoño.
Todos los organismos vivos recurren a la Apoptosis para eliminar células defectuosas
o cerrar respuestas biológicas, una vez cumplidas las tareas fisiológicas
que le dieron origen (159,160).
Mediante este recurso los humanos eliminamos diariamente unos 60000 millones
de células y sus componentes son reutilizados para generar células que intervendrán
en nuevos destinos funcionales (161).
El 98 % de las Células B y T activa mecanismos de apoptosis en el curso de su
desarrollo. Estas células son eliminadas por ineptitud frente a la delicada tarea de
distinguir entre moléculas propias y extrañas (162,163).
Solo un 2% de las células B y T es aprobado por los controles de calidad del
sistema inmune adaptativo (164).
También la apoptosis sirve para moderar la respuesta inmune. Las células B y T se
multiplican por estímulo antigénico hasta destruir al germen causal, luego la proliferación
se detiene, las células con función “memoria” son preservadas y el resto es
“desarmado” mediante apoptosis (165).
Por otra parte, la ablación experimental del TCR o BCR activa automáticamente
la apoptosis de Células T o B, porque el organismo descarta automáticamente
toda célula que no pueda cumplir el rol biológico asignado (166).
La Sindactilia y otras alteraciones morfogenéticas ocurren por defectos en los
mecanismos de apoptosis (167).
El ojo utiliza la apoptosis para eliminar gran cantidad de células en etapas
tempranas de su desarrollo y la detiene para completar su diferenciación. Una vez
alcanzada su madurez funcional el ojo expresa TGF-β2 y Fas L, para activar la
apoptosis de aquellos linfocitos que pudieren infiltrar la córnea y provocar daño
inflamatorio. Este fenómeno se conoce como “privilegio inmune” y depende básicamente
del sistema Fas-L/Fas-R de activación de apoptosis (168).
Las células que entran en apoptosis presentan encogimiento, aparición de mamelones
en la membrana sin pérdida de integridad, condensación de cromatina, fragmentación
de cromosomas en segmentos nucleosomales y empaquetamiento de contenidos
celulares en vesículas apoptoicas. Los macrófagos completan la tarea fagocitando células
apoptoicas y contribuyendo a reciclar sus componentes biológicos (169).
Nótese la diferencia con la Necrosis que se caracteriza por edema y disrupción
de la membrana celular, con liberación de su contenido al microambiente y desencadenamiento
de respuesta inflamatoria (170).
Los rutas apoptoicas confluyen de una u otra forma a nivel mitocondrial. Estas
organelas constituyen el transformador energético de la célula y su desfuncionalización
provoca muerte celular independiente de caspasas.
En el espacio formado entre sus membranas externa e interna, las mitocondrias
guardan proteínas activadoras y reguladoras de caspasas. La permeabilización de la
membrana mitocondrial externa permite el acceso de estas proteínas al citosol y la
activación de caspasas efectoras 3, 6 y 7. Dichas enzimas modifican substratos específicos
e inducen transformaciones morfológicas típicas de células en apoptosis (171).
La permeabilidad de la membrana externa de las mitocondrias (MOM) está regulada
de manera precisa y extremadamente sofisticada por proteínas de la familia Bcl-2.
En esta familia de más de veinte miembros se reconocen inhibidores, sensibilizadores
y activadores de las proteínas efectoras Bax y Bak.
La activación de Bax y Bak conduce a la permeabilización de la MOM, liberación de
activadores de caspasas y perturbación de la actividad energética mitocondrial (172).
El proceso de apoptosis se dispara cuando las moléculas Bax y Bak logran
desprenderse del complejo inhibitorio de la familia Bcl-2 y pueden oligomerizar,
instalar poros y permeabilizar la MOM.
Todo el sistema activador/regulador de Bax/Bak lleva el nombre genérico B
Cell Linfoma 2 (Bcl-2), que identifica a la 2da proteína purificada a partir de
extractos de Linfoma Folicular. Dicha molécula es el producto resultante de la
fusión genética entre el gen Bcl-2 “silvestre” o Wild Type (WT) posicionado en el
Cromosoma 18 (Cr 18q21) y el enhancer de Inmunoglobulinas de Cadena Pesada
(IGH) ubicado en Cr 14.
En dicho contexto la expresión de Bcl-2 queda bajo influencia del enhancer IGH, su
producción alcanza niveles muy altos y facilita el desarrollo de Linfoma Folicular (173).
En Leucemia Linfática Crónica también se registra sobre-expresión de Bcl-2
pero por diferente mecanismo. Normalmente la expresión del gen BCL2 está
controlada a nivel postranscripcional por micro-RNAs y los genes codificantes
de estos últimos son miR-15 y miR-16. Dichos genes se encuentran delecionados
o inactivados por mutaciones en el 70% de los casos de Leucemia Linfática Crónica.
El decremento en micro-RNAs moduladores del m-RNA de Bcl-2 provoca
incremento en la producción del inhibidor de apoptosis (174).
Pero en su versión normal, el gen de la proteína Bcl-2 permanece en su locus
original y se expresa en función de un concierto regulatorio muy ajustado.
La tarea normal de Bcl-2 es prevenir la activación de las moléculas efectoras
de apoptosis Bax y Bak, porque cuando esto ocurre dichas proteínas oligomerizan
e instalan poros en la membrana mitocondrial externa. A partir de ese momento
el fenómeno de apoptosis se torna irreversible, porque las proteínas proapoptoicas
Smac-DIABLO, Citocromo-C, Omi/HtrA2 y AIF, pasan al citosol, inducen la formación
de “apoptosomas”, activación de caspasas y desmantelamiento celular (171).
La unión de Citocromo C a la proteína adaptadora Apaf-1 pone en marcha
la construcción del “Apoptosoma”, que es un complejo multimérico integrado por
Apaf-1, Citocromo C, (d)ATP y pro-caspasa 9. En dicho contexto se produce la
activación autocatalítica de Caspasa-9 que adquiere conformación homodimérica
y activa las Caspasas Efectoras 3, 6 y 7. Estas a su vez se ocupan de desarmar la
célula de manera ordenada (171,175,176).
La actividad de las caspasas se encuentra modulada por una familia de
Proteínas Inhibidoras de Apoptosis (IAPs). Entre las múltiples funciones de las
IAPs están incluídas: unión e inhibición de caspasas, regulación de la progresión
del ciclo celular y modulación de las señalizaciones mediadas por receptores. Los
miembros XIAP y c-IAP1 de esta familia son ubiquitinizados y degradados en
proteosomas, como respuesta a estímulos apoptoicos y cuando esto ocurre la activación
de Caspasas se torna irreversible.
La activación de apoptosis por desfuncionalización de moléculas IAP parece ser particularmente
importante para frenar la respuesta inmune dependiente de células T (177).
Sobre detalles estructurales de las proteínas IAP referimos a revisiones especializadas, pero es importante remarcar que poseen dominios RING con actividad “E3 ligasa de ubicuitina” y que esta es una función crítica para la degradación proteosomal de IAPs y Caspasas.
Mientras no surjan señales activadoras de apoptosis, la función ubicuitinizante RING
permanecerá orientada a la degradación proteosomal de Caspasas y la célula sobrevivirá.
Pero las señales de apoptosis orientan la función RING de las IAPs hacia la
auto-ubicuitinización y degradación proteosomal. Con esto las caspasas quedan libres
de su efecto inhibitorio y proceden a ejecutar el mecanismo de apoptosis (178).
Decíamos que entre sus membranas externa e interna la mitocondria guarda moléculas
activadoras y moduladoras de caspasas. Una de estas es una proteína conocida por los
acrónimos Smac y DIABLO. Smac significa Segundo Activador de Caspasas Derivado
de Mitocondrias. El gen que codifica Smac/DIABLO expresa una proteína provista de
señal de ubicación mitocondrial. Cuando pasa a su forma madura Smac pierde dicha
señal por clivaje enzimático. La permeabilización de la MOM libera Smac/DIABLO al
citosol, este se acopla a las moléculas IAP y activa las caspasas 3 y 9. Para actuar sobre las
IAPs las proteínas Smac/DIABLO también deben formar homodímeros (179).
La apoptosis puede iniciarse por vía extrinseca mediante activación de
receptores de membrana (Fas-L/Fas-R) o intrínseca por permeabilización de
la membrana mitocondrial externa (MOM).
La vía extrínseca mediada por interacción ligante-receptor Fas se describe más
arriba, porque Fas-L/Fas-R forman parte de la gran familia TNF de citokinas.
Como mencionáramos antes, la desfuncionalización del sistema Fas/Fas-R provoca
en ratas transgénicas un síndrome parecido al Lupus Eritematoso Diseminado.
Esto sugiere que la apoptosis inducida por vía extrínseca parece jugar un rol crítico
en modulación de la respuesta inmune. Sin embargo ya hemos dicho que el fenómeno
de apoptosis está regulado myormente a nivel mitocondrial, principalmente por
proteínas de la familia Bcl-2.
De todas maneras, en ciertos tipos celulares la vía extrínseca converge con la
ruta mitocondrial de apoptosis, por clivaje y activación de Bid mediado por caspasas.
Veremos más adelante que la proteína Bid es un modulador endógeno de la
interacción Bcl-2/Bax (180).
La vía intrínseca puede ser inducida mediante diversos estímulos: drogas antineoplásicas,
hipoxia, irradiación, deprivación de factores de crecimiento y golpe de calor (181).
Dichos estímulos conducen a la permeabilización de la Membrana Mitocondrial
Externa (MOMP), liberación al citosol de moléculas proapoptoicas Citocromo-C, Smac/
DIABLO, Omi/HtrA2 y AIF y formación del multiproteico “Apoptosoma” (181,171).
El Citocromo-C es una proteína mitocondrial pequeña y móvil, que tiene a cargo
el transporte de electrones en la última fase de producción aeróbica de energía. Dichos
electrones surgen del metabolismo de la glucosa y son entregados al oxígeno, para que
este pueda finalmente asociarse a iones Hidrógeno y formar agua. El Citocromo-C
realiza su trabajo en el compartimiento ubicado entre las membranas externa e interna
de las mitocondrias. Toma y entrega electrones entre grandes complejos proteicos ligados
a la membrana. El Citocromo-C es una proteína muy antigua, esencial para toda
forma de vida terrestre y altamente preservada en su curso evolutivo (182).
Pero la liberación de Citocromo-C al citosol, actúa sobre el receptor del Inositol
3 Fosfato promoviendo liberación masiva de Calcio desde el Retículo Endoplásmico.
Y una concentración muy alta de Calcio en el citosol es tóxica para la célula.
Por otra parte, el Citocromo-C liberado de su empaquetamiento mitocondrial,
promueve en el citosol la activación de Procaspasa 9 y la caspasa 9 activa las caspasas
3 y 7 efectoras de apoptosis (182).
Para alcanzar este efecto sobre la pro-caspasa 9 el Citocromo-C debe incorporarse
al apoptosoma (183).
Sin embargo, es importante señalar que el proceso de apoptosis no depende exclusivamente
de la activación de la cascada de Caspasas, porque la neutralización de estas
enzimas no siempre impide la consumación de la muerte celular. De hecho la permeabilización
de la MOM es particularmente crítica en el proceso de apoptosis inducido por
activación del Receptor Antigénico de Células B (BCR). Y en este modelo el mecanismo
de apoptosis prosigue a pesar de estar inhibida la ruta de las caspasas (184).
La activación del TNF-α provoca apoptosis independiente de caspasas en neutrófilos
colectados de individuos sanos. Esto pudo demostrarse mediante tratamiento
previo de los neutrófilos con inhibidores de caspasas de amplio espectro. Obviamente
la de-represión de la activación de caspasas acelera el proceso de apoptosis (185).
No obstante estas consideraciones, las proteínas liberadas desde el mencionado
espacio intermembranoso mitocondrial integran la vía más poderosa de activación
de caspasas y mecanismos asociados de apoptosis.
Finalmente es importante remarcar que el proceso de apoptosis responde a la
ley del todo o nada, porque una vez activadas las proteínas efectoras Bax y Bak, el
poro de la membrana mitocondrial externa se abre, la salida de los activadores de
caspasas es irreversible y la muerte celular programada imposible de detener.

Caspasas y motivos CARD
Las caspasas son enzimas Calcio dependientes conocidas como Cisteín-Proteasas, porque
utilizan Cisteína para reaccionar con el Acido Aspártico de sus proteínas substrato.
Las nueve caspasas identificadas hasta ahora se dividen en caspasas iniciadoras
y efectoras. Las iniciadoras activan proformas inactivas y generan caspasas
efectoras. Las Caspasas 2, 8, 9 y 10 son iniciadoras o “apicales” y las Caspasas 3, 6
y 7 efectoras o “ejecutadoras”, porque fragmentan otras proteínas y conducen a la
apoptosis celular. La iniciación de la cascada de caspasas está modulada por inhibidores
de caspasas (186,187,188).
Las caspasas están reguladas a nivel postranscripcional de manera tal que puedan
ser rápidamente activadas. Son sintetizadas como procaspasas y poseen un prodominio,
una pequeña subunidad y otra de mayor tamaño. El prodominio de las
caspasas iniciadoras es de mayor tamaño que el de las efectoras.
En el “pro-dominio” de las caspasas iniciadoras se distinguen dominios “CARD”
(caspasa 2 y 9) o “DED” (caspasas 8 y 10), que son los que capacitan a estas moléculas
para interactuar con proteínas reguladoras de su activación (186,187,188).
Los dominios para reclutamiento de caspasas “CARD” son motivos interactivos
que se encuentran en un amplio rango de proteínas: helicasas, kinasas,
proteínas mitocondriales y caspasas.
CARD son arreglos de seis o siete alfa hélices antiparalelas que poseen un núcleo
hidrofóbico y una superficie compuesta de residuos con carga eléctrica negativa.
Dentro de esta categoría de estructuras interactivas están incluidas las secuencias
PYD (dominio piridina), DD (dominio muerte) y DED (dominio efector muerte).
Todas ellas aparecen en proteínas primariamente vinculadas a inflamación o apoptosis
y son funcionales a los requerimientos de oligomerización de estas moléculas.
Los motivos CARD están presentes tanto en proteínas de apoptosis del gusano
Cenorabditis Elegans como en caspasas humanas 1, 4, 5, 9 y 15 (186,187,188).
Estas moléculas responden a estímulos mediante agrupamiento u oligomerización,
factor crítico para su autoactivación automática y ulterior activación
de caspasas efectoras.
Entre los blancos enzimáticos de las Caspasas figuran la proteína fibrosa
“Lamin”, el Inhibidor de DNAsa Activada por Caspasa (ICAD), la Poli-ADP
Ribosa Polimerasa (PARP) y la Kinasa 2 activada por P21 (PAK2).
Lamin son proteínas que contribuyen a la formación de una lámina proteinácea
subyacente a la membrana nuclear. Los homodímeros de Lamin son desarmados por
fosforilación instrumentada por el Factor de Promotor de Mitosis. Obviamente su degradación
mediada por Caspasa 6 provoca daño irreparable a nivel del núcleo celular.
Por otra parte decíamos que ICAD es Inhibidor de la DNAsa “CAD”.
Nomalmente CAD integra un complejo inactivo con el Inhibidor de CAD
(ICAD), pero la caspasa 3 fragmenta a ICAD y libera CAD activo.
Uno de los efectos característicos de la apoptosis es la fragmentación del DNA
en unidades nucleosomales, fenómeno que ocurre precisamente por activación de
CAD, inhibición de enzimas de reparación del DNA y degradación de proteínas
estructurales del núcleo (189,190).
Otro evento crítico en apoptosis es la degradación proteolítica de PARP-1 que
es una proteína nuclear involucrada en la reparación, estabilidad y regulación transcripcional
del DNA. PARP-1 es blanco de las Caspasas Efectoras 3 y 7 (191,192).
La cascada de caspasas puede activarse mediante Granzyma B (caspasas 3 y 7),
FAS, TNF (caspasas 8 y 10) o Citoctomo-c (caspasa 9).
La activación de la apoptosis vía Receptores Muerte (Fas/Fas-R) resulta
típicamente en la activación de una caspasa de iniciación como ocurre con las
Caspasas 8 y 10 y estas activan en cascada otras caspasas conduciendo a la activación
de las caspasas efectoras 3 y 6. Estas últimas resultan en la fragmentación de
proteínas del citoesqueleto u otras moléculas, provocando los cambios morfológicos
típicos de apoptosis (193,194).
La proteína Granzyme B, liberada por los Linfocitos T (CD8) Citotóxicos,
puede activar de manera directa las caspasas 3, 7, 8 y 10 y provocar también disrupción
de la Membrana Externa Mitocondrial (MOM) (195).
Por otra parte el Citocromo c liberado por las mitocondrias vía Bid > Bak/Bax
provoca la activación de caspasa 9 y esta a su vez activa la caspasa 3. En este caso
Bid, que es una molécula “BH3 only” y activadora de Bax, es a su vez activada vía
Caspasas Apicales (196).

Familia Bcl-2 y Regulación Fisiológica de la Apoptosis
Ya hemos mencionado que la permeabilidad de la membrana mitocondrial externa
(MOMP) está regulada por sutiles interacciones entre las 25 proteínas de la familia
Bcl-2 (197,198).
La expresión de la versión normal del gen Bcl-2, ubicada en el Cr 18q21, está
sometida a rigurosa regulación transcripcional y postranscripcional. Las proteínas
Bcl-2 y Bcl-XL ejercen fuerte efecto inhibitorio sobre las moléculas efectoras de
apoptosis Bax, Bak y Bok (199).
A partir de ahora cuando hablemos de Bcl-2 convengamos que NO nos estamos
refiriendo al Bcl-2 “de fusión”, sino a la versión silvestre de Bcl-2 (WT) que
opera desde su locus cromosómico normal posicionado a nivel Cr 18q21.
Bcl-2 es una proteína integral de membranas intracelulares (200,201).
Uno de los primeros eventos relacionados con apoptosis es la pérdida del
potencial de membrana mitocondrial y este fenómeno es suprimido por la
proteína Bcl-2 (202).
Bcl-2 bloquea la liberación de Citocromo-c del espacio intemembrana mitocondrial
e impide su interacción sobre el activador de caspasas Apaf-1.
Bcl-2 se destaca sobre las 25 moléculas de esta familia, por haber sido la primera
en descubrirse y por desplegar poderoso efecto antiapoptoico (203).
El balance entre moléculas pro y anti-apoptoicas de familia Bcl-2, mediado
por iteracciones proteína-proteína, determina si la célula entrará o no al desarmadero
apoptoico (204).
En las proteínas de familia Bcl-2 se reconocen dominios o secuencias llamadas
BH por “homología con Bcl-2”. Los primeros fueron descritos por Yin et al en
1994 y actualmente se reconocen cuatro: BH1, BH2, BH3 y BH4. Los motivos
BH1 y BH2 son necesarios para la heterodimerización Bcl-2/Bax y es precisamente
por este mecanismo que Bcl-2 previene la permeabilización de la MOM (205).
La secuencia BH3 es un dominio alfa helicoidal anfipático de 20 Amino Acidos
(AA) de longitud, que despliega fuerte afinidad por el mencionado bolsillo
hidrofóbico de las moléculas antiapoptoicas Bcl-2. La interacción BH3 dependiente
entre moléculas “BH3 only” y Bcl-2/Bcl-XL, deja libre de inhibición a las
proteínas Bax/Bak y habilita el mecanismo de apoptosis (206,207).
Las moléculas “pro-apoptoicas” Bax y Bak operan a nivel de membranas mitocondriales
y de retículo endoplásmico (ER) y son miembros “efectores” distales del
sistema Bcl-2. Bax, Bak y Bok son también conocidas como proteínas multidominios
por compartir dominios BH1, BH2 y BH3 (208,209).
Las proteínas Bax y Bak son formadoras de poros en la Membrana Mitocondrial
Externa (MOM). El extenso “sistema Bcl-2” gira alrededor de Bax y Bak, en
un juego de activación y represión de estas proteínas efectoras de apoptosis.
En animales “doble deficientes” en Bax/Bak, sometidos a señales intrínsecas de
stress, no se detecta activación de caspasas. Esto prueba que Bax y Bax son moléculas
esenciales para la vía intrínseca de activación de caspasas (210).
Es importante señalar que la proteína Bax permanece inactiva (latente) en
el citosol de muchas células. En estas condiciones el dominio C-terminal Trans
Membrana (TM) se encuentra plegado y oculto en el interior de la proteína. El
cambio conformacional que los activadores inducen en Bax, facilita la exposición
del dominio TM, su inserción en la membrana mitocondrial, oligomerización
y formación de poros (211).
Acorde con sofisticados estudios estructurales, los dominios BH1, BH2 y BH3
de las proteínas anti-apoptoicas (Bcl-2/Bcl-XL) se pliegan en un dominio globular
que posee un “surco” hidrofóbico en la superficie (212).
El dominio alfa helical BH3 de las proteínas pro-apoptoicas se une a este sitio hidrofóbico
y neutraliza a proteínas anti-apoptoicas como Bcl-2, Bcl-XL u otras (213).
Dicho de otra manera, la heterodimerización entre moléculas pro y anti
apoptoicas depende de la integridad del dominio BH3, que difiere cláramente
de BH1 y BH2 (214).
Las células “saludables” cuentan con nivel suficiente de proteínas antiapoptoicas
como para prevenir la activación de Bax/Bak. La aparición de
señales inductoras de apoptosis provoca activación de proteínas “BH3 only”,
estas se unen BH3 mediante a Bcl-2/Bcl-XL y desplazan a Bax/Bax del complejo
inhibidor (215).
Una vez liberados, Bax/Bak se insertan en la membrana mitocondrial, forman
multímeros, provocan el colapso del potencial de membrana, liberan proteínas
apoptogénicas y la célula termina desmantelada (216).
Los moléculas de familia Bcl-2 puden segregarse en tres subgrupos: 1) moléculas
“efectoras” Bax, Bak, Bok, que contienen hasta tres regiones BH (BH1,
BH2, BH3) y despliegan alto grado de similitud con Bcl-XL; 2) proteínas “BH3
only” como Bad, Bik, Blk, Nbk, Hrk, Bid, Bim, Noxa, Puma y Bmf que solamente
comparten el dominio BH3 y 3) miembros antiapoptoicos o “pro”-sobrevida como
Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w, A1 y Mcl-1 (217).
La sobre expresión de “BH3 only” no activa la apoptosis en fibroblastos deficientes
en Bax/Bak, pero si lo hace en fibroblastos normales. Esto demuestra que
Bax/Bak constituyen el verdadero “epicentro” de la apoptosis (218).
Las moléculas pro-sobrevida Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w, A1 y Mcl-1 comparten
cuatro dominios homólogos BH (BH1-BH4), excepto Mcl-1 que solo tiene tres
secuencias BH3 (217).
Estas proteínas son cruciales para la sobrevida celular y la pérdida de cualquiera
de ellas ocasiona transtornos en el control poblacional de ciertas líneas celulares. En
modelos transgénicos de raton se demostró que todos ellas son esenciales para la sobrevida
de linfocitos, melanocitos, progenitores eritroides o neuronas (219,220,221).
La deficiencia en Mcl-1 provoca muerte de embriones en estadio temprano
de desarrollo y su deleción en linajes T o B provoca rápida pérdida de
linfocitos maduros (222).
Las moléculas “BH3 only” operan de manera singular o parcialmente superponible,
mediante afinidad BH3 dependiente, sobre moléculas antiapoptoicas Bcl-2 (223).
PUMA y Bim pueden unirse a miembros de toda la familia anti-apoptoica:
Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w, A1 y Mcl-1.
Bad y Bmf solo interactúan con Bcl-2, Bcl-XL y Bcl-w.
Bid, Birk y Hrk se unen fuertemente a Bcl-XL, Bcl-w y A1 y sólo despliegan
débil atracción por Bcl-2 y Mcl-1.
Noxa se une solamente a Mcl-1 y A1 (224).
Acorde con un modelo propuesto por Don Newmeyer’s et al, las proteínas Bid
y Bim serían activadores directos de Bax/Bak y el resto serían de-represores de la
interacción inhibitoria entre Bcl-2/Bcl-XL y Bax/Bak. Un exceso en de-represores
prevendría el secuestro de activadores directos por moléculas Bcl-2 y los dejaría
libres para actuar sobre Bax y Bak (225).
Un subgrupo de moléculas “BH3 only”, entre las que se encuentran Bid, Bim
y Puma, comparte la doble función de antagonista de las antiapoptoicas Bcl-2 y
Bcl-XL y agonista de las efectoras Bax, Bak y Bok.
Es preciso remarcar que varias moléculas “BH3 only”, en particular Bid y Bim,
pueden unirse y activar a Bax y Bak de manera directa (226).
Estos conceptos alentaron el desarrollo de miméticos “BH3 only” para inducción
farmacológica de apoptosis en células cancerosas. Obviamente, para llegar a
productos de potencial utilidad clínica fue necesario lograr suficiente permeabilidad
celular, biodisponibilidad, solubilidad y estabilidad metabólica (227).
Luego de mucho trabajo Abbott Laboratories logró desarrollar la droga
de infusión endovenosa ABT-737, que es un potente y específico inhibidor
de Bcl-2/Bcl-XL (228).
In Vitro este producto induce apoptosis en células cancerosas e In Vivo, asociado a
drogas convencionales, ha sido probado con éxito en estudios clínico-oncológicos (229).
A partir del ABT-737 Abbott desarrolló el compuesto ABT-263 de absorción
oral y con este inició estudios clínicos, solo o en combinación con esquemas convencionales,
en diversas malignidades hematológicas (230).
Siguiendo otra línea de ideas, es importante mencionar que mediante manipulación
experimental, es posible también cambiar el fenotipo de las proteínas Bcl-2
y Bcl-XL, de inhibidor a potenciador de apoptosis (231).
Por cierto esta es otra estrategia farmacológica proapoptoica que podría también
contribuir a modificar la historia natural de diverso tipo de malignidades.

Activación de la Cascada MAPK
Las Protein-Kinasas Activadas por Mitógenos (MAPKs) son Kinasas que responden
a estímulos extracelulares (Mitógenos) provocando la fosforilación de
sitios Serina y Treonina.
Vía MAPKs, TNFα induce fuerte activación de un grupo de Kinasas relacionadas
al stress, llamadas c-Jun N-terminal Kinasas (JNK). De estas se conocen al
menos tres versiones: MAPK8, MAPK9 y MAPK10. Las Kinasas JNK constituyen
uno de los seis subgrupos de proteínas de la familia MAPK (232,233).
También puede generar TNFα moderada respuesta de p38-MAPK y mínima
respuesta de ERKs, ambos también subgrupos de la familia MAPK.
El adaptador TRAF2 induce la activación de MAP-Kinasa-Kinasa-Kinasa 1
(MEKK1) y Apoptosis Signal-regulating Kinase 1 (ASK1) y estas fosforilan (activan)
a la kinasa JNK.
Una vez activada JNK se traslada al núcleo y allí activa factores transcripcionales
como c-Jun y ATF2.
Las proteínas c-Jun y c-Fos integran el complejo Proteína Activadora 1 (AP-1)
que es un factor transcripcional heterodimérico (c-Jun/c-Fos) (234).
AP-1 estimula la transcripción de genes que contienen elementos de respuesta
conocidos como 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA). El
complejo AP-1 se une a los elementos TPA de los promotores de dichos genes
mediante dominios leucine zipper (235) (Ver Genética).
En definitiva, la ruta MAPK estimulada por TNFα activa la ruta JNK y esta induce
la transcripción de genes involucrados en diferenciación celular, proliferación y apotosis.

Ras / MAPK
Cuando un RTK es activado por unión a su ligante, las Tirosinas de su proyección
citosólica son fosforiladas y transformadas en sitios de anclaje para moléculas
de señales portadoras de motivos SH2 o PTB. Las proteínas Grb2 y Sos
forman complejo y se pegan a los Sitios Fosfotirosinas del RTK activado. Para
esto Grb2 utiliza un dominio SH2 y expone a Sos próximo a la membrana, cerca
de Ras que es una proteína G. Entonces cataliza el intercambio de GDP por
GTP quedando así activada la proteína Ras que activará varias proteínas, particularmente
Raf que a su vez fosforila una Serina cercana al sitio de activación de
la kinasa MAPKK. Esta última fosforila residuos Treonina y Tirosina de MAPK
(ERK1/2) habilitando su activación. MAPK activa por fosforilación substratos
citoplasmáticos y Factores Transcripcionales. Estos se desplazan al núcleo para
regular la expresión de genes que intervienen en proliferación, diferenciación,
apoptosis y respuesta inmune (238,239,240).
Las fosforilaciones sobre residuos serina, treonina o tirosina, provocan importantes
modificaciones postraduccionales, en proteínas que intervienen en mecanismos
críticos para el control de diversas actividades celulares. El nivel de fosforilación
de una proteína resulta de la actividad coordinada de Kinasas y Fosfatasas. La
importancia del status de fosforilación en diversas moléculas se evidencia en la gran
cantidad de genes codificantes de estas enzimas. Se estima que el exoma humano
codifica unas 2000 kinasas y 500 fosfatasas destinadas al control de la fosforilación
proteica y regulación de funciones celulares esenciales. Estas predicciones resultan
de extrapolaciones a partir de observaciones realizadas en organismos más simples,
como Cenorabditis Elegans y Drosophyla Melanogaster (241).

Activación de NF-κB
A la proteína TRADD se adhieren las moléculas TRAF2 y Serin-Treonin Kinasa RIP. En dicho contexto TRAF2 recluta al complejo llamado Kinasa IKK y este es activadao por RIP.
En estado de reposo la proteína IκBα permanece complejada al factor transcripcional NF-κB, ocultando el sitio de localización nuclear de esta proteína (236).
En estado de activación la proteína IκBα es fosforilada y degradada por el complejo Kinasa IKK. A raíz de esto queda desbloqueado el sitio de localización nuclear de NF-κB y habilitada su inmediata translocación a núcleo celular.
NF-κB es una molécula heterodimérica que induce la activación de un extenso grupo de genes involucrados en sobrevida, proliferación celular, respuesta inflamatoria y factores antiapoptoicos (237).

PI3K
La activación de RTKs suele también habilitar la activación de la Kinasa responsable de fosforilar la posición 3 del anillo Inositol (PI3K). Esta kinasa también tiene dominios SH2 y puede entonces ligarse a Sitios Fosfotirosina en la cola citosólica de los RTKs activados. Como decíamos más arriba la PI3K genera Fosfatidil-3-Inositol que funciona como sitio de anclaje y activación para kinasas Btk, Itk, PDK1 y Akt (PKB).
La activación de Akt promueve sobrevida, proliferación y crecimiento celular y está implicado particularmente en cáncer de mama.

PLCγ
La activación de RTKs promueve el reclutamiento de la enzima Fosfo Lipasa C gamma (PLCγ). Esta enzima utiliza módulos SH2 para su unión a sitios Fosfotirosina del RTK. De esta manera PLCγ queda posicionada en la membrana cerca de su substrato específico, el lípido Fosfatidil Inositol Difosfato o PI(4,5)P2. Esta enzima degrada al PI (4,5) P2 en Inositol 3 Fosfato (IP3) y Diacilglicerol (DG). El IP3 es liberado de la membrana para anclarse y habilitar el poro de ingreso de calcio al citosol. El Ca++ se une entonces a la Calmodulina y esta activa una familia de Kinasas dependientes de ella. Por otra parte DG y Ca++ activan a miembros de la Proteina Kinasa C (PKC). Estos mensajeros secundarios culminan su tarea estimulando procesos celulares tales como proliferación, angiogénesis y motilidad.


REFERENCIAS
1. Bounte T, Owada MK, Donner P, Boschek CB et al (1981) Association of the transformation specific protein pp60scr with the membrane of an avian sarcoma virus. J Virol 38: 1034-1047.
2. Fambrough D, McClure K, Kazlauskas A, Lander ES (1999) Diverse signaling pathways activated by growth factor receptors induce broadly overlapping, rather than independent, sets of genes. 11; 97(6) pp 675-678.
3. Cantley, LC; Auger, KR; Carpenter, C; Duckworth, B; Graziani, A; Kapeller, R; Soltoff, S. Oncogenes and signal transduction. Cell. 1991 Jan 25;64(2):281–302.
4. Bagrodia S, Chackalaparampil I, Kmiecik T, Shalloway D. (1991) Tyrosin 527 phosphorilation and mitotic activation of p60src Nature (London) 349:172-175
5. Taylor ST, Anafi M, Pawson T, Shalloway D (1995) Functional interaction between c-Scr and its mitotic target, Sam 68. J Biol Chem Vol 270, Nº 17, pp 10120-10124.
6. Deininger M, Druker BJ. (2003) Specific Targeted Therapy of Chronic Myelogenous Leukemia with Imatinib. Pharmacol Rev; 55:401-423.
7. Pardanani A (2008) JAK2 inhibitor therapy in myeloproliferative disorders: rationale, preclinical studies and ongoing clinical trials Leukemia 22, 23–30
8. Sicheri F, Kurivan J (1997) Structures of Src-family tyrosine kinases. Curr Opin Struct Biol. Dec; 7(6) pp 777-785.
9. Gonfloni S, Williams JC, Hattula K, Weijland A et al (1997) The role of the linker between the SH2 domain in the regulation and function of Src. EMBO J, Dec 15, 16 (24): pp 7261-7271.
10. LaFevre-Bernt M, Sicheri F, Pico A, Porter M, Kuriyan J, Miller WT. (1998) Intramolecular regulatory interactions in the Src family kinase Hck probed by mutagenesis of a conserved tryptophan residue Nov 27, 273 (48) 32129-32134.
11. Liu X, Pawlson T (1994) Biochemistry of the Src protein-tyrosine kinase: regulation by SH2 and SH3 domains. Recent Prog Horm Res 49; 149-160.
12. Pawson T and Nash Piers (2000) Protein-protein interactions define specificity in signal transduction Genes & Dev 14 , pp 1027-1047.
13. Jin L, Pluskey S, Petrella EC, Cantin SM et al (2004)The Three-dimensional Structure of the ZAP-70 Kinase Domain in Complex with Staurosporine. IMPLICATIONS FOR THE DESIGN OF SELECTIVE INHIBITORS. J. Biol. Chem., Vol. 279, Issue 41, pp 42818-42825.
14. Pawson T, Scout JD (1997) Signaling through scaffold, anchoring and adaptor proteins. Science Vol 278, Nº 5346, pp 2075-2080.
15. Anderson D, Koch CA, Grey L, Ellis C et al (1990) Binding of SH2 domains of phospholipase Cγ1, GAP and Src to activated growth factor receptors. Science 250: 979-982.
16. Courtneidge SA, Kypta RM, Cooper JA, Kazlauskas A (1991) PDGF receptors sequences important for kinases binding of SRC family tyrosine. Cell Growth Diff 2: 483-486.
17. Bormann BJ (1992) Intramembrane Helix-Helix association in oligomerization and transmembrane signaling. Annu Rev Biophys Biomol Struct21:223-242.
18. Heldin CH, Ostman A, Ronnstrand L (1998) Signal transduction via platelet-derived growth factor receptors. Biochim. Biophys. Acta 1378:F79–F113
19. Heldin CH (1995) Dimerization of cell surface receptors in signal transduction. Cell 80: 213-223.
20. Ekman S, Thuresson ER, Heldin CH, Ronnstrand LL (1999) Increased mitogenecity of an αβ heterodimeric PDGF receptor complex correlates with lack of RasGAP binding. Oncogene 18:1-8.
21. Eck MJ, Atwell SK, Shoelson SE, Harrison SC (1993) Recognition of a High-Affinity phosphotyrosyl peptide by the Src homology 2 domain of 56 lck. Nature 362: 87-91.
22. Vetter IR, Nowak C, Nishimoto T, Kuhlmann J, Wittinghofer A (1999) Structure of a Ran-binding domain complexed with Ran bound to a GTP analogue: Implications for nuclear transport. Nature 398:39–46
23. Pascal SM, Singer AU, Gish G, Yamazaki T et al (1994) Nuclear magnetic resonance structure of an SH2 domain of phospholipase C-gamma1 complexed with a high affinity binding peptide. Cell 77:461–472.
24. Songyang Z. Shoelson SE, Chadhuri M, Gish G et al (1993) Identification of phosphotyrosine peptide motifs which bind to SH2 domains. Cell 72:767–778.
25. Songyang Z, Gish G, Mbamalu G, Pawson T, Cantley LC. (1995) A single point mutation switches the specificity of group III Src homology (SH)2 domains to that of group I SH2 domains. J. Biol. Chem. 270:26029–26032.
26. Larose L, Gish G, Pawson T (1995) Construction of an SH2 domain binding site with mixed specificity. J Biol Chem Vol 270, Nº8, 3858-3862.
27. Marengere LEM, Songyang Z, Gish GD, Schaller MD et al (1994) SH2 domain specificity and activity modified by a single residue. Nature 369:502–505
28. Z hou MM, Ravichandran KS, Olejniczak ET, Petros AM et al (1995) Structure and ligand recognition of the phosphotyrosine binding domain of Shc. Nature 378:584–592.
29. Trub T, Choi WE, Wolf G, Ottinger E et al (1995) Specificity of the PTB domain of Shc for β turn-forming pentapeptide motifs amino-terminal to phosphotyrosine. J. Biol. Chem. 270:18205–18208.
30. Borg JP, Ooi J, Levy E, Margolis B (1998)The phosphotyrosine interaction domains of X11 and FE65 bind to distinct sites on the YENPTY motif of amyloid precursor protein. Mol. Cell. Biol. 16:6229–6241.
31. Schultz J, Copley RR, Doerks T, Ponting CP et al (2000) SMART: A web-based tool for the study of genetically mobile domains. Nucleic Acids Res. 28:231–234.
32. Niebuhr K, Ebel F, Frank R, Reinhard M et al (1997) A novel proline-rich motif present in ActA of Listeria monocytogenes and cytoskeletal proteins is the ligand for the EVH1 domain, a protein module present in the Ena/VASP family. EMBO J. 16:5433–5444
33. Aghazadeh B, Rosen MK. (1999) Ligand recognition by SH3 and WW domains: The role of Nalkylation in PPII helices. Chem. Biol. 6:R241–R246.
34. Mayer B.J.(1999) Endocytosis: EH domains lend a hand. Curr. Biol. 9:R70–R73
35. Salcini AE, Confalonieri S, Doria M, Santolini E et al (1997) Binding specificity and in vivo
targets of the EH domain, a novel protein–protein interaction module. Genes & Dev. 11:2239–
2249.
36. Hillier BJ, Christopherson KS, Prepoda KE, Bredt DS, .Lim WA (1999) Unexpected Modes of
PDZ Domain Scaffolding Revealed by Structure of nNOS-Syntrophin Complex. Science Vol
284, Nº 5415, pp 812-815.
37. Stapleton D, Balan I, Pawson T, Sicheri F (1999) The crystal structure of an Eph receptor SAM
domain reveals a mechanism for modular dimerization. Nat. Struct. Biol. 6:44–49.
38. Fruman DA, Rameh LE, Cantley LC (1999) Phosphoinositide binding domains: Embracing 3-
phosphate. Cell 97:817–820.
39. Foster FM, Traer CJ, Abraham SM and Fry MJ (2003) The phosphatidilonositide (PI) 3-Kinase
Family. J Cell Sci 116, pp3037-3040.
40. Corvera S (2000) Signal Transduction: Stuck with FYVE Domains. Sci STAKE Vol 2000, Issue
37, Pe1.
41. Mao Y, Nickitenko A, Duan X, Lloyd TE et al (2000) Crystal structure of the VHS and FYVE
tandem domains of Hrs a protein involved in membrane trafficking and signal transduction. Cell
100:447–456.
42. Wurmser AE, Gary JG and Emr SD (1999) Phosphoinositide 3-Kinases and Their FYVE Domain-
containing Effectors as Regulators of Vacuolar/Lysosomal Membrane Trafficking Pathways
J Biol Chem, Vol. 274, Issue 14, 9129-9132.
43. Sato, T. K., Overduin, M. and Emr, S. D. (2001). Location, location, location: membrane targeting
directed by PX domains. Science 294, 1881-1885.
44. Haslam RJ, Koide HB and Hemmings BA. (1993) Pleckstrin domain homology. Nature 363,
309–310
45. Schultz J, Copley RR, Doerks T, Ponting CP and Bork P (2000) SMART: web-based tool for the
study of genetically mobile domains. Nucleic Acids Res. 28, 231–234.
46. Cozier, G. E., Carlton, J., Bouyoucef, D. and Cullen, P. J. (2004). Membrane targeting by pleckstrin
homology domains. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 282, 49-88.
47. Walker, S. A., Cozier, G. E. and Cullen, P. J. (2004). GFP fusion proteins to study signaling in live
cells. Methods Mol. Biol. 273, 407-420.
48. Várnai, P. and Balla, T. (1998). Visualization of phosphoinositides that bind pleckstrin homology
domains: calcium-and agonist-induced dynamic changes and relationship to myo-[3H]inositollabeled
phosphoinositide pools. J. Cell Biol. 143, 501-510.
49. Lemmon MA and Ferguson KM. (2000) Signal-dependent membrane targeting by pleckstrin
homology (PH) domains Biochem. J. 350, 1–18.
50. Overduin M, Cheever ML, Kutateladze TG (2001) Signaling with Phosphoinositides. Mol Interv
Vol1, Issue 3, pp 150-159.
51. Wenk, M. R. and de Camilli, P. (2004). Protein-lipid interactions and phosphoinositide metabolism
in membrane traffic: insights from vesicle recycling in nerve terminals. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 101, 8262-8269.
52. DiNitto, J. P., Cronin, T. C. and Lambright, D. G. (2003). Membrana recognition and targeting
by lipid-binding domains. Sci. STKE 213, 1-16.
53. Forman-Kay, J. D. and Pawson, T. (1999). Diversity in protein recognition by PTB domains. Curr.
Opin. Struct. Biol. 9, 690-695.
54. Yun M., Keshvara L., Park, CG., Zhang YM, et al. (2003). Crystal structures of the Dab homology
domains of mouse disabled 1 and 2. J. Biol. Chem. 278, 36572-36581.
55. Christy AH, Kim AC, Marfatia SM, Lutchman M et al (1998). The FERM domain: a unique
module involved in the linkage of cytoplasmic proteins to the membrane. Trends Biochem. Sci.
23, 281-282.
56. Hamada, K., Shimizu, T., Matsui, T., Tsukita, S. and Hakoshima, T.(2000). Structural basis of the
membrane targeting and unmasking mechanisms of the radixin FERM domain. EMBO J. 19,
4449-4462.
57. Hamada K, Shimizu T, Matsui T, Tsukita S and Hakoshima T (2000). Structural basis of the
membrane targeting and unmasking mechanisms of the radixin FERM domain. EMBO J. 19,
4449-4462.
58. Hamada K, Shimizu T, Yonemura S, Tsukita S. and Hakoshima T. (2003). Structural basis of
adheson-molecule recognition by ERM proteins revealed by the crystal structure of the radixin-
ICAM-2 complex. EMBO J. 22, 502-514.
59. Blobe GC, Schiemann WP, Lodish HF (2000) Role of Transforming Growth Factor β in Human
Disease N Eng J Med 342: 1350-1358.
60. Taipale J, Saharinen J, Keski-Oja J. (1998) Extracellular matrix-associated transforming growth
factor-ß: role in cancer cell growth and invasion. Adv Cancer Res 75:87-134.
61. Sinha S, Nevett C, Shuttleworth CA, Kielty CM. (1998) Cellular and extracellular biology of the
latent transforming growth factor-ß binding proteins. Matrix Biol 17:529-545.
62. Crawford SE, Stellmach V, Murphy-Ullrich JE, et al. (1998) Thrombospondin-1 is a major activator
of TGF-ß1 in vivo. Cell 93:1159-1170.
63. Wrana JL, Attisano L, Wieser R et al (1994) Mechanic of action of the TGF-beta receptor. Nature
370 (6488) 341-347.
64. Nakao A, Imamura T, Souchelnytskyi S, et al. (1997) TGF-ß receptor-mediated signalling
through Smad2, Smad3 and Smad4. EMBO J 16:5353-5362.
65. Runyan CE, Schnaper HW, Poncelet AC (2005) The Role of Internalization in Transforming
Growth Factor_1-induced Smad2 Association with Smad Anchor forReceptor Activation
(SARA) and Smad2-dependent Signaling in Human Mesangial Cells. J Biol Chem 280 (9)
8300-8308.
66. Wu G, Chen Y, Ozdamar B ey al (2000) Structural Basis of Smad2 Recognition by the Smad
Anchor for Receptor Activation Science 287, 92-97.
67. Itoh F, Divecha N, Brocks L et al (2002) The FYVE domain in Smad anchor for receptor activation
(SARA) is sufficient for localization of SARA in early endosomes and regulates TGF-
β/Smad signalling Genes to Cells 7, 321–331
68. Massague J. TGF-ß signal transduction. (1998) Annu Rev Biochem 199867:753-791.
69. Horvath CM (2004) The Jak-STAT Pathway Stimulated by Interferon α or Interferon β. Sci
STKE Issue 260, p tr10.
70. Graus TA, Lau JF, Parisien JP, Horvath CM (2003) A hybrid IRF9-STAT2 protein recapitulates
interferon-stimulated gene expresión and antiviral response. J Biol Chem 278 (15) 13033-13038.
71. Paun A, Pitha PM (2007) The IRF Family, revisted. Biochimie 89 (6-7) 744-753.
72. Nagano Y, Kojima Y (1958). “Inhibition de l’infection vaccinale par un facteur liquide dans le tissu
infecté par le virus homologue” (in French). C. R. Seances Soc. Biol. Fil. 152 (11): 1627–1629.
73. Watanabe Y (December 2004). “Fifty years of interference”. Nat. Immunol. 5 (12): 1193.
74. Ferrari, Anna (2001). Dizionario di mitologia greca e latina. Milan: Rizzoli.
75. Yamaoka K, Saharinen P, Pesu M et al (2004) The Janus Kinases (Jaks). Genome Biol 5 (12) 253
76. Manning G, Whyte DB, Martinez R, Hunter T, Sudarsanam S (2002) The protein kinase complement
of the human genome. Science, 298:1912-1934.
77. Saharinen P, Takaluoma K, Silvennoinen O: (2000) Regulation of the Jak2 tyrosine kinase by its
pseudokinase domain. Mol Cell Biol 20:3387-3395.
78. Chen M, Cheng A, Candotti F et al (2000) Complex effects of naturally occurring mutations in
the JAK3 pseudokinase domain: evidence for interactions between the kinase and pseudokinase
domains. Moll Cell Biol 20(3)947-956.
79. Z hou YJ, Hanson EP, Chen YQ, Magnuson K, Chen M, Swann PG, Wange RL, Changelian PS,
O’Shea JJ: Distinct tyrosine phosphorylation sites in JAK3 kinase domain positively and negatively
regulate its enzymatic activity. Proc Natl Acad Sci USA 1997, 94:13850-13855.
80. Tortolani PJ, Lal BK, Riva A, Johnston JA, Chen YQ, Reaman GH, Beckwith M, Longo D,
Ortaldo JR, Bhatia K, et al.: Regulation of JAK3 expression and activation in human B cells and
B cell malignancies. J Immunol 1995, 155:5220-5226.
81. Hofmann SR, Lam AQ, Frank S, Zhou YJ, Ramos HL, Kanno Y, Agnello D, Youle RJ, O’Shea JJ:
Jak3-independent trafficking of the common gamma chain receptor subunit: chaperone function
of Jaks revisited. Mol Cell Biol 2004, 24:5039-5049.
82. Witthuhn BA, Quelle FW, Silvennoinen O, Yi T, Tang B, Miura O, Ihle JN: JAK2 associates with
the erythropoietin receptor and is tyrosine phosphorylated and activated following stimulation
with erythropoietin. Cell 1993, 74:227-236.
83. Cirri P, Chiarugi P, Marra F et al (1997) c-Src Activates both STAT1 and STAT3 in PDGFStimulated
NIH3T3 Cells Biochem Biophys Res Com 239 (2) 493-497.
84. Yin T, Shen R, Feng GS, Yang YCh (1997) Molecular Characterization of Specific Interactions
between SHP-2 Phosphatase and JAK Tyrosine Kinases. J Biol Chem 272 (2) 1032-1037.
85. Larsen L, Ropke C (2003) Suppressors of Citokine Signalling: SOCS. APMIS 110(12) 833-
844.
86. Fujimoto, M, Naka, T. Regulation of cytokine signaling by SOCS family molecules. Trends Immunol.
2003. 24:659-666.
87. Tan J, Hall SH, Hamil KG et al (2000) Protein Inhibitor of Activated STAT-1 (Signal Transducer
and Activator of Transcription-1) Is a Nuclear Receptor Coregulator Expressed in Human
Testis. Mol Endocrin 14 (1) 14-28.
88. Strieter, R., Kunkel, S., Bone, R. 1993. Role of Tumor Necrosis Factor-Alpha in Disease States
and Inflammation. Critical Care Medicine. 21 (10 Supplement) : S447-S463.
89. Tracey, K., Cerami, A. 1990. Metabolic Response to Cachectin/TNF. Annals of the New York
Academy of Sciences : Vol. 587. Eds. Boland, B, Cullinan, J., Kimball, C. New York : New York
Academy of Sciences. 325-330.
90. Janeway, c., Travers, P., Walport, M., Capra, J. Immunobiology : The Immune System in Health
and Disease. New York, N.Y : Garland Publishers. 1999.
91. Rink, L., Kirchner, H. 1996. Recent Progress in the Tumor Necrosis Factor-Alpha Field. International
Archives of Allergy and Immunology. 111 (3) : 199-209.
92. Beutler, B., Greenwald, D., Hulmes, J., Chang, M., Pan, Y., Mathison, J., Ulevitch, R., Cerami,
A. 1985a. Identity of Tumour Necrosis Factor and the Macrophage-Secreted Factor Cachectin.
Nature. 316 (8) : 552-554.
93. Beutler, B., Milsark, L., Cerami, A. 1985b. Passive Immunization Against Cachectin/Tumor Necrosis
Factor Protects Mice from Lethal Effects of Endotoxin. Science 229 : 867-871.
94. Dempsey PW, Doyle SE, He JQ, Cheng G The signaling adaptors and pathways activated by
TNF superfamily.
95. Watts TH (2004) TNF/TNFR FAMILY MEMBERS IN COSTIMULATION OF T CELL
RESPONSES Annu Rev Immunol 23:23-68.
96. Vogel LA, Noelle RJ (1998) CD40 and its crucial role as a member of the TNFR family. Sem
Immunol 10 (6) 435-442.
97. Loetscher H, Pan YC, Lahm HW et al (1990) Molecular cloning and expression of the human
55kd tumor necrosis factor receptor. Cell, 61: 351–359.
98. Smith CA, Davis T, Anderson D et al (1990) A receptor for tumor necrosis factor defines an
unusual family of cellular and viral proteins.Science (Wash. DC) 248: 1019–1023.
99. Pennica D, Nedwin GE, Hayflick JS et al (1984). “Human tumour necrosis factor: precursor
structure, expression and homology to lymphotoxin”. Nature 312 (5996): 724–729.
100. Miscia S, Marchisio M, Grilli A, et al (2002) Tumor Necrosis Factor α (TNF- α) Activates Jak1/
Stat3-Stat5B Signaling through TNFR-1 in Human B Cells1. Cell Growth Differ 13:131-18.
101. Jones, E.Y. 2000. The tumour necrosis factor receptor family: life or death choices. Curr. Opin.
Struct. Biol. 10:644-648.
102. Locksley, R.M., Killeen, N., Lenardo, M.J. 2001. The TNF and TNF receptor superfamilies: integrating
mammalian biology. Cell. 104:487-501.
103. Eck, M.J., Sprang, S.R. 1989. The structure of tumor necrosis factor-α at 2.6 A resolution. J. Biol.
Chem. 264:17595-17605.
104. Dempsey PW, Doyle SE, He JQ, Cheng G (2003) The signaling adaptors and pathways activated
by TNF superfamily. 14 (3-4) : 193-209.
105. Norris PS, Ware CF (2007) The LT beta R signaling pathway. Adv Exp Med Biol. 597:160-72
106. Banks TA, Rickert S, Benedict CA et al (2005) A lymphotoxin-IFN-beta axis essential for lymphocyte
survival revealed during cytomegalovirus infection. J Immunol. 2005 Jun 1;174(11):7217-
25
107. Wu Q, Sun Y, Wang J (2001) Signal via lymphotoxin-beta R on bone marrow stromal cells is
required for an early checkpoint of NK cell development. J Immunol. Feb 1;166(3):1684-2689.
108. McCarthy DD, Summers-Deluca L, Vu F et al (2006) The lymphotoxin pathway: beyond lymph
node development. Immunol Res. 35(1-2):41-54
109. Kriegler M, Perez C, DeFay K, Albert I, Lu SD (1988). “A novel form of TNF/cachectin is a cell
surface cytotoxic transmembrane protein: ramifications for the complex physiology of TNF”. Cell
53 (1): 45–53.
110. Tang P, Hung M-C, Klostergaard J (1996). “Human pro-tumor necrosis factor is a homotrimer”.
Biochemistry 35 (25): 8216–8225
111. Wajant H, Pfizenmaier K, Scheurich P (2003). “Tumor necrosis factor signaling”. Cell Death
Differ. 10 (1): 45–65.
112. Chen G, Goeddel DV (2002). “TNF-R1 signaling: a beautiful pathway”. Science 296 (5573):
1634–1635.
113. Erickson SL, De Sauvage FJ, Kikly K et al (2002) Decreased sensitivity to tumour-necrosis factor
but normal T-cell development in TNF receptor-2-deficient mice. Nature 372: 560-563.
114. Wajant H. (2002) The Fas signaling pathway: more than a paradigm. Science 296:1635–1636.
115. Xiao T, Towb P, Wasserman SA, Sprang SR. (1999) Three-dimensional structure of a complex
between the death domains of Pelle and Tube. Cell 199999:545–555.
116. Thakar J, Schleinkofer K, Borner C and Dandekar T. (2006) RIP Death Domain Structural Interactions
Implicated in TNF-Mediated Proliferation and Survival. PROTEINS: Structure, Function,
and Bioinformatics 63:413–423
117. Costanzo A, Guiet C, Vito P (1999). “c-E10 is a caspase-recruiting domain-containing protein
that interacts with components of death receptors signaling pathway and activates nuclear factorkappaB.”.
J. Biol. Chem. 274 (29): 20127–32.
118. Hsu H, Xiong J, Goeddel DV (1995). “The TNF receptor 1-associated protein TRADD signals
cell death and NF-kappa B activation.”. Cell 81 (4): 495–504.
119. Baker SJ, Reddy EP (1999). “Modulation of life and death by the TNF receptor superfamily.”.
Oncogene 17 (25): 3261–70.
120. Hsu H, Shu HB, Pan MG, Goeddel DV (1996). “TRADD-TRAF2 and TRADD-FADD interactions
define two distinct TNF receptor 1 signal transduction pathways.”. Cell 84 (2): 299–
308.
121. Takeuchi M, Rothe M, Goeddel DV (1996). “Anatomy of TRAF2. Distinct domains for nuclear
factor-kappaB activation and association with tumor necrosis factor signaling proteins.”. J. Biol.
Chem. 271 (33): 19935–42.
122. Fries KM, Sempowski GD, Phipps RP, et al. (1995) CD40 expression by human fibroblasts. Clin
Immunol Immunopathol. 77:42-51.
123. Henn V, Slupsky JR, Grafe M, et al. (1998) CD40 ligand on activated platelets triggers an inflammatory
reaction of endothelial cells. Nature. 5:591-594.
124. Bingaman AW, Pearson TC and Larsen CP. (2000) The role of CD40L in T cell-dependent nitric
oxide production by murine macrophages. Transpl Immunol 8(3) 195-202.
125. Chamekh M (2007) CD40/CD40L Interaction in Immunity Against Protozoan Infections. J
Biomed Biotechnol 59430.
126. Bluestone JA, Khattri R, van Seventer GA. Accesory Molecules. In: Paul WE, ed. Fundamental
Immunology. Fourth Edition ed. Phildelphia: Lippincott-Raven Publishers, 1999:449-78.
127. Mackey MF, R.J. B, Noelle RJ. The role of CD40/CD154 interactions in the priming, diffentiation,
and effector funcion of helper and cytotoxic T cell. Journal of Leukocyte Biology 1998;63:418-428.
128. van Kooten, C; Banchereau, J. (1997) Functions of CD40 on B cells, dendritic cells and other cells.
Curr Opinin Immunolo. 9(3):330–337
129. Hollenbaugh, D; Grosmaire, LS; Kullas, CD, et al. (1992) The human T cell antigen GP39, a
member of the TNF gene family, is a ligand for the CD40 receptor: expression of a soluble form
of GP39 with B cell co-stimulatory activity. The EMBO Journal. 11(12):4313–4321
130. Foy TM, Aruffo A, Bajorath J, Buhlmann JE, Noelle RJ. Immune Regulation by CD40 and its
Ligand GP39. Annu Rev Immunol 1996;14:591-617.
131. Noelle RJ, Roy M, Shepherd DM et al. (1992) A 39-kDa protein on activated helper T cells
binds CD40 and transduces the signal for cognate activation of B cells. Proc Natl Acad Sci U S
A. 89:6550-6554.
132. Aruffo A, Farrington M, Hollenbaugh D, et al. The CD40 ligand, gp 39, is defective in activated
T cells from patient with X-linked hyper-IgM syndrome. Cell 1993;72:291-300.
133. Grewal IS, Flavell RA. CD40 and CD154 in cell-mediated immunity. Annu Rev Immunol
1998;16:111-135.
134. Siddiqa A, Sims-Mourtada JC, Guzman-Rojas L et al (2001) Regulation of CD40 and CD40
ligand by the AT-hook transcription factor AKNA. Nature 410(6826):383-7.
135. Galy, A.H., Spits, H. (1992). CD40 is functionally expressed on human thymic epithelial cells. J.
Immunol. 149, 775–782
136. Sekine, C., Yagita, H., Miyasaka, N., Okumura, K. (1998). Expression and function of CD40 in
rheumatoid arthritis synovium. J. Rheumatol. 25, 1048–1053
137. Pearson LL, Castle BE, Kehry MR (2001) CD40-mediated signaling in monocytic cells: up-regulation
of tumor necrosis factor receptor-associated factor mRNAs and activation of mitogenactivated
protein kinase signaling pathways. Internat Immunol 13: 273-283.
138. de Boer M, Kasran A, Kwekkeboom J et al (1993) Ligation of B7 with CD28/CTLA-4 on T
cells results in CD40 ligand expression, interleukin-4 secretion and efficient help for antibody
production by B cells. Eur J Immunol. 23:3120-3125.
139. Ding L, Green JM, Thompson CB, Shevach EM. (1995) B7/CD28-dependent and -independent
induction of CD40 ligand expression. J Immunol. 155: 5124-5132.
140. Johnson-Leger C, Christensen J, Klaus GG. (1998) CD28 co-stimulation stabilizes the expression
of the CD40 ligand on T cells. Int Immunol. 10:1083-1091.
141. Lederman S, Yellin MJ, Krichevsky A et al (1992) Identification of a novel surface protein on
activated CD4_ T cells that induces contact-dependent B cell differentiation (help). J Exp Med.
175:1091-1101.
142. Aruffo A, Farrington M, Hollenbaugh D, et al. (1993) The CD40 ligand, gp39, is defective in
activated T cells from patients with X-linked hyper-IgM syndrome. Cell. 72:291-300.
143. Sacco MG, Ungari M, Cato EM, et al. (2000) Lymphoid abnormalities in CD40 ligand transgenic
mice suggest the need for tight regulation in gene therapy approaches to hyper immunoglobulin
M (IgM) syndrome. Cancer Gene Ther. 7:1299-1306.
144. Scout RD, Sutiles J, Xu J et al (1996) Impaired T cell-mediated macrophage activation in CD40
ligand-deficient mice. J Immunol 156: 8-11.
145. Starling GC, Kiener PA, Aruffo A, Bajorath J. (1998) Análisis of the ligand binding site in Fas
(CD95) by site-directed mutagenesis and comparison with TNFR and CD40. Biochem 37 (11)
3723-3726.
146. Bajorath J (1999) Identification of the ligand binding site in Fas (CD95) and analysis of Fasligand
interactions. Proteins 35 (4) 475-482.
147. Orlinick JR, Vaishnaw AK, Elkon KB (1999) Structure and Function of Fas/Fas ligand. Int Rev
Immunol 18 (4) 293-308.
148. Xerry L, Devilard E, Hassoun J et al (1997) Fas ligand is not only expressed in immune privileged
human organs but is also coexpressed with Fas in various epithelial tissues. J Clin Pathol: Mol
Pathol 50 (87) 91.
149. Powell, W. C., Fingleton, B., Wilson, C. L et al (1999) The metalloproteinase matrilysin proteolytically
generates active soluble Fas ligand and potentiates epithelial cell apoptosis. Curr. Biol. 9:
1441–1447
150. Schneider, P., Holler, N., Bodmer, J. L., Hahne, M., Frei, K., Fontana, A., and Tschopp, J. Conversion
of membrane-bound Fas(CD95) ligand to its soluble form is associated with downregulation
of its proapoptotic activity and loss of liver toxicity. J. Exp. Med., 187: 1205–1213, 1998.
151. Tanaka, M., Itai, T., Adachi, M., and Nagata, S. Downregulation of Fas ligand by shedding. Nat.
Med., 4: 31–36, 1998.
152. Cascino I, Papoff G, Eramo A, Ruberti G (2004). “Soluble Fas/Apo-1 splicing variants and apoptosis.”.
Front. Biosci. 1: d12–8.
153. Krammer PH (2000). “CD95’s deadly mission in the immune system.”. Nature 407 (6805): 789–95.
154. Wajant H (2002) The Fas Signaling Pathway: More Than a Paradigm Science 296: 1635-1636.
155. Watanabe-Fukunaga R, Brannan CI, Copeland NG et al (1992) Lymphoproliferation disorder in
mice explained by defects in Fas antigen that mediates apoptosis. Nature (Lond.) 356:314–317.
156. Takahashi T, Tanaka M, Brannan CI et al (1994). Generalized lymphoproliferative disease in
mice, caused by a point mutation in the Fas ligand. Cell. 76:969–976.
157. Lynch D, Watson M, Alderson MR et al (1994). The mouse Fas-ligand gene is mutated in gld
mice and is part of a TNF family gene cluster. Immunity. 1:131–136.
158. Wu J, Wilson J, He J et al (1996) Fas Ligand Mutation in a Patient with Systemic Lupus Erythematosus
and Lymphoproliferative Disease. J Clin Invest 98 (5) 1107-1113.
159. Afford, S.C., S. Hubscher, A.J. Strain et al (1995). Apoptosis in the human liver during allograft
rejection and end stage liver disease. J. Pathol. 176(4) 373-380.
160. Krams, S.M., H. Egawa, M.B. Quinn, J.C. et al (1995) Apoptosis as a mechanism of cell death in
liver allograft rejection. Transplantation (Baltimore). 59: 621-625 373-380
161. Reed JC (2008) Bcl-2 family proteins and hematologic malignancies: history and future prospects.
ASH 50th anniversary review pp 235-242.
162. Alam SM, Travers PJ, Wung JL et al. (1996) T cell receptor affinity and thymocyte positive selection. Nature 381:616-620.
163. Singer GG, Abbas AK. (1994) The Fas antigen is involved in peripheral but not thymic deletion
of T lymphocytes in T cell receptor transgenic mice. Immunity 1:365-371.
164. Iwata M, Ohoka Y, Kuwata T, Asada A (1996) Regulation of T Cell Apoptosis via T Cell Receptors and Steroid Receptors. Stem Cells 14(6) 632-641.
165. Baumann S, Krueger A, Kirchhoff S, Krammer PH.(2002) Regulation of T cell Apoptosis during
the Immune Response Curr Mol Med 2(3) 257-272.
166. Polic B, Kunkel D, Scheffolds A, Rajewsk K (2001) How αβ T cells deal with induced TCRα
ablation. PNAS 98 (15) 8744-49.
167. Z ou H, Niswander L (1996) Requirement for BMP signaling in interdigital apoptosis and scale
formation. Science 272(5262) 738-741.
168. Lang RA (1997) Apoptosis in mammalian eye development: lens morphogenesis, vascular regression
and immune privilege. Cell Death Differentiation 4(1) 12-20.
169. Fernandez Flores A, Aguilera B, Yau P and Oliva H. (2002) An old meaning of the word apoptosis.
Lancet 359: 1072.
170. Fiers, W., Beyaert, R., Declercq, W., and Vandenabeele, P. (1999). More than one way to die:
apoptosis, necrosis and reactive oxygen damage. Oncogene 18, 7719-7730
171. Z ou H, Li Y, Liu X, Wang X (1999) An APAF-1. cytochrome c multimeric complex is a functional
apoptosome that activates procaspase-9. J Biol Chem, 274(17):11549-11556.
172. Dejean LM, Martinez-Caballero S, Manon S, Kinnally KW. Regulation of the mitochondrial
apoptosis-induced channel, MAC, by BCL-2 family proteins. Biochim. Biophys. Acta.
2006;1762(2):191-201.
173. Vaandrager JW, Schuuring E, Phlippo K, Kluin P. (2000) V(D)J recombinase-mediated transposition
of the BCL2 gene to the IGH locus in follicular Lymphoma. Blood 96 (5) 1947-1952.
174. Cimmino A, Calin GA, Fabbri M et al. (2005) miR-15 y miR 16 induce apoptosis by targeting
BCL2. Proc Nat Acad Sci USA 102: 13944-13949.
175. Kuida K, Haydar TF, Kuan C et al (1998) Reduced apoptosis and cytochrome c-mediated caspase
activation in mice lacking caspase 9. Cell, 94(3):325-337.
176. Cory S and Adams JM (2002) The Bcl-2 family: regulators of the cellular life-or-death switch.
Nat. Rev. Cancer 2: 647–656.
177. Yi Li Yang and Xiao Ming Li (2000) The IAP family: endogenous caspase inhibitors with multiple
biological activities. Cell Res 10: 169-177.
178. Vaux DL, Silke J. (2005) IAPs – the ubiquitin connection. Cell Death Differentiation 12: 1205-
1207.
179. Shiozaki EN and Shi Y (2004) Caspases, IAPs and Smac/DIABLO: mechanisms from structural
biology. Trens Biochem Sci 29(9) 486-494.
180. Korsmeyer SJ, Wei MC, Saito M et al (2000) Proapoptoic cascade activates Bid, which oligomerizes
Bak o Bax into pores that result in the release of cythocrome c. Cell Death Differ 7: 1166-1173.
181. Van Loo G, Saelens X, Van Gurp M et al. (2002) The role of mitochondrial factors in apoptosis:
a Russian roulette with more than one bullet. Cell Death Differ 9 (10): 1031-1042.
182. Liu X, Kim C, Yang J, Jemmerson R, Wang X (1996). “Induction of apoptotic program in cell-free
extracts: requirement for dATP and cytochrome c”. Cell 86 (1): 147–57.
183. Kuida K, Haydar TF, Kuan CY et al (1998) Reduced apoptosis and cytochrome c-mediated caspase
activation in mice lacking caspase 9. Cell 94(3):325-337.
184. Bouchon A, Krammer PH, Walczak H. (2000) Critical role for mitochondria in B cell receptormediated
apoptosis. Euro J Immunol 30 (1) 69-77.
185. Liu CY, Takesama A, Liles WC et al (2003) Broad-spectrum caspase inhibition paradoxically augments
cell death in TNF-α stimulated neutrophils. Blood, 1 January 2003, Vol. 101, No. 1, pp. 295-304.
186. Hiscott J, et al. (2006). “MasterCARD: a priceless link to innate immunity”. Trends Mol Med 12:53-56.
187. Hong GS, Junk YK (2002). “Caspase recruitment domain (CARD) as a bi-functional switch of
caspase regulation and NF-kappaB signals”. J Biochem Mol Biol 35: 19–23
188. Bouchier-Hayes L, Martin SJ (2002). “CARD games in apoptosis and immunity”. EMBO Rep 3: 616
189. D Tang, VJ Kidd (1998) Cleavage of DFF-45/ICAD by multiple caspases is essential for its
function during apoptosis. J Biol Chem 273: 28549-52.
190. Taimen P, Kallajoki M (2003) NuMa and nuclear Lamins behave differently in Fas mediated
apoptosis. J Cell Sci 116: 571-583
191. Leist, M., Single, B., Kunstle, G., Volbracht, C., Hentze, H., and Nicotera, P. (1997a). Apoptosis in
the absence of poly-(ADP-ribose) polymerase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 518-522
192. Los M, Mozoluk M, Ferrari D et al (2002) Activation and Caspase-mediated Inhibition of
PARP: A Molecular Switch between Fibroblast Necrosis and Apoptosis in Death Receptor Signaling
MBC Vol. 13, Issue 3, 978-988.
193. Nagata S (1997). “Apoptosis by death factor.”. Cell 88 (3): 355–65.
194. Siegel RM, Chan FK, Chun HJ, Lenardo MJ (2001). “The multifaceted role of Fas signaling in
immune cell homeostasis and autoimmunity.”. Nat. Immunol. 1 (6): 469–74.
195. Goping IS, Barry M, Liston P et al (2003) Granzyme B-induced apoptosis requires both direct
caspase activation and relief of caspase inhibition. Immunity 18(3):355-65
196. Milhas D, Cuvillier O, Therville N et al (2005) Caspase-10 triggers bid cleavage and caspase
cascade activation in FasL-induced apoptosis JBC vol. 280 (20) 19836-19842
197. Martinez-Caballero S, Dejean LM, Jonas EA, Kinnally KW. The role of the mitochondrial apoptosis
induced channel MAC in cytochrome c release. J. Bioenerg. Biomembr. 2005;37:155-164
198. Chao DT, Korsmeyer SJ. BCL-2 family: regulators of cell death. Annu Rev Immunol. 1998;16:395-
419. Review.
199. Vaux DL, Cory S, Adams JM. Bcl-2 gene promotes haemopoietic cell survival and cooperates
with c-myc to immortalize pre-B cells. Nature 1988;335:440
200. Tsujimoto Y, Ikegaki N, Croce CM (1987) Characterization of the protein product of Bcl-2, the
gene involved in human follicular lymphoma. Oncogene 2:3-7.
201. Hockenbery DM, Nuñez G, Millman C et al (1990) Bcl-2 is an inner mitochondrial membrane
protein that blocks programmed cell death. Nature 348: 334-336.
202. Z amami N, Marchetti P, Castedo M et al (1995) Reduction in mitochondrial potencial constitutes
an early irreversible steo of programmed lymphocyte death in vivo. J Exp Med 181: 1661-1672.
203. Yang J, Liu X, Bhalla K et al (1997) Prevention of apoptosis by Bcl-2: release of Cytichrom C
from mitochondria blocked. Science 275: 1129-1132.
204. Danial, NN; Korsmeyer, SJ. (2004) Cell death. Critical control points. Cell, 116:205–219.
205. Yin XM, Oltvai ZN, Korsmeyer SJ (1994) BH1 and BH2 domains of Bcl-2 are required for
inhibition of apoptosis and heterodimerization with Bax. Natue 369: 321-333.
206. Sattler M, Liang H, Nettesheim D et al (1997) structure of Bcl-XL Bax peptide complex: recognition
between regulators of apoptosis. Science 275: 983-986.
207. Willis SN and Adams JM (2005) Life in the balance: how BH3-only proteins induce apoptosis.
Curr. Opin. Cell. Biol. 17: 617–625.
208. Ruiz-Vela A, Opferman JT, Cheng EHY & Korsmeyer SJ (2005) Proapoptoic Bax and Bak control
multiple initiator caspasas. EMBO reports 6, 4, 379-385.
209. Wei MC, Zoong WX, Cheng EH et al. (2001) Proapoptotic Bax and Bak: a requisite gateway to
mitochondral dysfunction and death. Science 292:727-730.
210. Ruiz-Vela A, Opferman JT, Cheng EHY & Korsmeyer SJ (2005) Proapoptoic Bax and Bak control
multiple initiator caspasas. EMBO reports 6, 4, 379-385.
211. Wolter KG, Hsu YT, Smith CL et al (1997) Movement of Bax from the cytosol to mitochondria
during apoptosis. J Cell Biol 139:1281-1292.
212. Sattler, M; Liang, H; Nettesheim, D, et al. Structure of Bcl-xL-Bak peptide complex: recognition
between regulators of apoptosis. Science. 1997;275:983–986.
213. Petros, AM; Nettesheim, DG; Wang, Y, et al. Rationale for Bcl-xL/Bad peptide complex formation
from structure, mutagenesis, and biophysical studies. Protein Sci. 2000;9:2528–2534.
214. Chittenden T, Flemington C, Houghton AB et al (1995) A conserved domain y Bak, diferente de
BH1 y BH2, mediated cell death and protein binding functions. EMBO 14: 5589-5596.
215. Cheng, EH; Wei, MC; Weiler, S; Flavell, RA; Mak, TW; Lindsten, T; Korsmeyer, SJ. BCL-2,
BCL-X(L) sequester BH3 domain-only molecules preventing BAX- and BAK-mediated mitochondrial
apoptosis. Mol. Cell. 2001;8:705–711.
216. Green, DR; Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 004;305:626–629.
217. Strasser A (2005) The role of BH3-only proteins in the immune system. Nat. Rev. Immunol. 5:
189–200.
218. Z ong WX, Lindsten T, Ross AJ, MacGregor GR and Thompson CB (2001) BH3-only proteins
that bind pro-survival Bcl-2 family members fail to induce apoptosis in the absence of Bax and
Bak. Genes Dev. 15: 1481–1486.
219. Veis DJ, Sorenson CM, Shutter JR and Korsmeyer SJ (1993) Bcl-2-deficient mice demonstrate
fulminant lymphoid apoptosis, polycystic kidneys, and hypopigmented hair. Cell 75: 229–240.
220. Motoyama N, Wang FP, Roth KA, Sawa H, Nakayama K, Nakayama K, Negishi I, Senju S,
Zhang Q, Fujii S and Loh DY (1995) Massive cell death of immature hematopoietic cells and
neurons in Bcl-x deficient mice. Science 267: 1506–1510.
221. Opferman JT, Iwasaki H, Ong CC, Suh H, Mizuno S, Akashi K and Korsmeyer SJ (2005) Obligate
role of anti-apoptotic MCL-1 in the survival of hematopoietic stem cells. Science 307: 1101–
1104.
222. Opferman JT, Letai A, Beard C, Sorcinelli MD, Ong CC and Korsmeyer SJ (2003) Development
and maintenance of B and T lymphocytes requires antiapoptotic MCL-1. Nature 426: 671–676.
223. Chen L, Willis SN, Wei A et al (2005) Differential targeting of prosurvival Bcl-2 proteins by their
BH3-only ligands allows complementary apoptotic function. Mol. Cell. 17: 393–403.
224. Chen, L; Willis, SN; Wei, A; Smith, BJ; Fletcher, JI; Hinds, MG; Colman, PM; Day, CL; Adams,
JM; Huang, DC. Differential targeting of prosurvival Bcl-2 proteins by their BH3-only ligands
allows complementary apoptotic function. Mol. Cell. 2005;17:393–403.
225. Kuwana T, Bouchier-Hayes L, Chipuk JE, Bonzon C, Sullivan BA, Green DR and Newmeyer
DD (2005) BH3 domains of BH3-only proteins differentially regulate Bax-mediated mitochondrial
membrane permeabilization both directly and indirectly. Mol. Cell. 17: 525–535.
226. Cartron, PF; Gallenne, T; Bougras, G; Gautier, F; Manero, F; Vusio, P; Meflah, K; Vallette, FM;
Juin, P. The first alpha helix of Bax plays a necessary role in its ligand-induced activation by the
BH3-only proteins Bid and PUMA. Mol. Cell. 2004;16:807–818.
227. Denicourt, C; Dowdy, SF. Medicine. Targeting apoptotic pathways in cancer cells. Science.
2004;305:1411–1418.
228. Oltersdorf, T; Elmore, SW; Shoemaker, AR, et al. An inhibitor of Bcl-2 family proteins induces
regression of solid tumours. Nature. 2005;435:677–681.
229. Z hang L, Ming L, Yu J. (2007) BH3 mimetics to improve cancer therapy; mechanisms and examples.
NIH Public Access. Author Manuscript.
230. Wang JL, Liu D, Zhang ZJ et al (2000) Structurre based discovery of an organic compound that
binds Bcl-2 protein and induces apoptosis of tumor cells. Proc Natl Acad Sci USA 97: 7124-7129.
231. Bivona TG, Quatela SE, Bodemann BO et al (2006) PKC regulates a farnesyl electrostatic switch
on K-Ras that promotes its association with Bcl-XL on mitochondia and induces apoptosis. Moll
Cell 21: 481-493.
232. Bohmann D, Bos TJ, Admon A et al (1998) “Human proto-oncogen c-jun encodes a DNA binding
protein with structural and functional properties of transcription factor AP-1” Science 238
(4832) 1386-1292
233. Rahmsodrf HJ (1997) “Jun: transcription factor and oncoprotein” J Mol Med 74 (12) 725-747
234. Glover JN, Harrison SC (1995) “Crystal structure of the heterodimeric bZIP transcription factor
c-Fos-c-Jun bound to DNA” Nature 373 (6511) 257-261
235. Hess J, Angel P, Schorpp Kistner M (2004) “AP-1 subunits: quarrel and harmony among siblings” J Cell Sci 117 (Pt 25) 5965-5973
236. Davis CC, Bern D, Young LS, Eliopoulos AG (2005) NF-kB overrides the apoptoic program of
TNF receptor 1 but not CD40 in carcinoma cells. Cellular Signalling 17(6) 729-738
237. Hauer J, Puschner S, Ramakrishnan P et al (2005) TNF receptor (TNFR) associated factor
(TRAF) 3 serves as an inhibitor of TRAF 2/5-mediated activation of the noncanonical NF-kB
pathway by TRAF-binding TNFRs. PNAS 102 (8) 2874-2879
238. Ferrel JE Jr (1996) MAP kinases in mitogenesis and development. Curr Top Dev Biol 33: 1-60.
239. Kato Y, Tapping RI, Huang S et al (1998) Bmk1/Erk5 is required for cell proliferation induced by epidermal growth factor. Nature (London) 395, 713-716.
240. Reszka AA, Bulinski JC, Krebs EG, Fischer EH (1997) Mitogen-activated protein kinase/extracelular signal-regulated kinase 2 regulates cytoskeletal organization and chemotaxis via catalytic and microtubule-specific interactions. Mol Biol Cell 8, 1219-1232.
241. The C. Elegans Sequencing Consortium (1998) Genome sequence of the nematoce C. elegans: a
platform for investigating biology. Science 282: 2012-2018.


*capitulo extraído del libro: El Sistema Inmune: Genética, Biología Molecular, Clínica, Farmacología / Autores: Ricardo Antonio Giuliani y Eleno Martínez Aquino - 1a. Ed. - Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.
Eritroferon S.R.L., 2011.
ISBN 978-987-27121-0-5