cap. 4. Recombinación de Genes para Receptores B y T
Autor:
Ricardo Antonio Giuliani
Las Células B y T completan su ciclo madurativo cuando logran instalar en su membrana
receptores antigénicos de exclusiva afinidad antigénica. Si producen versiones
defectuosas o autoractivas y no pueden corregirlas van a la apoptosis (1-3).
Una vez alcanzada su madurez la viabilidad de un linfocito depende en gran
medida de la integridad de sus receptores antigénicos. La mayor parte de los recursos
de un linfocito está al servicio de sus receptores B (BCR) o T (TCR).
La ablación experimental de los receptores B activa de inmediato la maquinaria
de apoptosis en cualquier etapa de su desarrollo (4) y lo mismo parece ocurrir en
células T CD8+. Por el contrario, las células T CD4+ que pierden sus TCR permanecen
viables durante largos períodos de tiempo (5).
La región de interacción con antígenos, en receptores B o T, despliega un alto grado
de variación en secuencias de AA. Por eso es conocida como (“Variable”). Para construir
esta región Variable las células disponen de un extenso catálogo de segmentos genéticos
agrupados en tres familias diferentes: Variable (V), Diverso (D) y Joint (J) (1-3).
En el curso de su diferenciación los linfocitos eligen al azar un ejemplar de cada
familia y así construyen un exon codificante de región variable, con afinidad específica
para una determinada estructura molecular. Al proceso que conduce a la creación de este
exon de fusión se le llama recombinación V(D)J. La D aparece entre paréntesis porque
los locus de cadenas livianas o cadenas T alfa y gama carecen de segmentos D (6).
Los re-arreglos V(D)J resultan en más de un millón de variantes, ergo es difícil
que dos linfocitos Naif exhiban receptores de similar afinidad antigénica. Por eso
el Sistema Inmune Adaptativo está virtualmente capacitado para responder contra
todo tipo de Antígeno concebible (1-3).
La recombinación V(D)J es un evento complejo y muy regulado que puede
abarcar más de una megabase y responde a patrones específicos de linaje celular y
estadio de desarrollo (1-3,6).
Los segmentos V(D)J son móviles y tienen jerarquía de transposones. De hecho las
proteínas que cargan con la mayor responsabilidad en los rearreglos de línea germinal, las
proteínas activadoras de la recombinasa (RAG), tienen función de transposasas (6,7,11).
Transposones son secuencias de DNA que pueden “translocarse” de un sitio
otro del genoma dentro de una misma célula. Por eso estos genes también fueron
llamados “genes saltadores” y constituyen ejemplos de elementos genéticos móviles.
Los “retrotransposones” pueden ser transcriptos a RNA, readquirir conformación
de DNA y reinsertarse en el genoma mediante transcriptasa reversa. Los
transposones pueden moverse dentro del genoma de manera directa, sin copiarse
a RNA. Para esto cuentan con una transposasa apta para extirparlos de un sitio
y reinstalarlos en otro.
El fenómeno de Exclusión Alélica
La expresión genética de los receptores antigénicos es necesariamente Monoalélica. Si
se re-arreglaran al azar los segmentos genéticos de los dos alelos de cadenas pesadas y
los cuatro alelos de cadenas livianas o sus equivalentes en cadenas T, resultarían receptores
de diversa afinidad antigénica y se violaría el principio de diversificación clonal.
Para evitar esto las células B y T cuentan con mecanismos de Exclusión Alélica: la
activación de un alelo implica el automático silenciamiento de los otros (1-3,8,9).
Característicamente, las cadenas pesadas o sus contrapartidas beta/gama en células
T, sirven para construir el eje del receptor antigénico. Una vez completado el
armado del gen de cadena pesada en un cromosoma, el proceso recombinatorio de
cadena pesada o beta/gamma de su homólogo queda silenciado definitivamente. Luego
se inicia la construcción de cadenas livianas, siempre en uno de los locus parentales.
Mientras esté activo uno de los locus los otros tres locus, es decir el otro locus kappa
y los dos locus lambda, permanecen inactivos (excluidos). Como resultado se produce
una cadena liviana que reemplaza a la subrogante en el complejo con cadena pesada.
Para iniciar su diferenciación el Linfocito B debe activar el locus genético de
Cadena Pesada de un solo Cromosoma (Cr). La activación del alelo de cadena
pesada en Cr 14 paterno implica el inexorable silenciamiento del Cr 14 materno.
Una vez producida la proteína de cadena pesada e instalada en la membrana, se inicia
la activación de un solo locus de cadena liviana Kappa en Cr 2 (materno o paterno).
Si no puede generar una cadena liviana apta para el armado de su receptor, pasa
al otro alelo Kappa y finalmente, si fracasa, lo vuelve a intentar con los locus de
cadena Lambda en Cr22, probando siempre primero con uno y luego con el otro.
La activación de los genes que codifican receptores T sigue una secuencia similar
(1-3, 8). Sin embargo veremos más adelante que el principio de exclusión alélica es
frecuentemente violado tanto en células T como B (29-31).
Siguiendo con las excepciones, es interesante señalar que un 15% de las células
ProB normales de ratón culmina los rearreglos de cadena liviana antes de completar
los rearreglos de cadenas pesadas (51).
Los Locus B de cadenas pesadas y livianas y sus equivalentes en Células T
En los receptores antigénicos se reconoce una región que tiene una secuencia de
aminoácidos (AA) muy Variable entre cada linfocito que completa su maduración.
Es esta secuencia la que determina el idiotipo del clon. El resto del receptor, dentro
de las características estructurales propias de cada versión B o T, varía muy poco
en secuencia de AA y por eso es conocido como región constante. Estas regiones
Variable y Constante caracterizan tanto a cadenas livianas como pesadas. Las clases
y subclases de Ig estan determinadas por el tipo de cadena pesada. El tipo de región
constante determina el isotipo (IgM, IgG, IgE, IgA) de Inmunoglobulina (1-3).
El receptor T (TCR) resulta de la combinación de cadenas alfa/beta o gamma/
delta. Más del 95% de losTCR son alfa/beta. En estos receptores las cadenas beta
y delta tienen una estructura parecida a las cadenas pesadas de Ig y las cadenas alfa
y gamma una estructura similar a las cadenas livianas de Ig. En estas moléculas se
identifica también una región variable y una región constante. El TCR está diseñado
para actuar exclusivamente a nivel de superficie celular (1-3).
El BCR funciona inicialmente como receptor y permanece anclado a la membrana
mediante una estructura hidrofóbica. Cuando alcanza un nivel óptimo de afinidad
por el antígeno y cambia su región constante de cadena pesada acorde con su destino
funcional, la célula comienza a segregarlo como inmunoglobulina (Ig). Una Ig es un
receptor B que carece de su región hidrofóbica: es la expresión soluble del BCR (1-3).
Las cadenas T alfa y delta se arman en Cr14. Los segmentos genéticos V/J de
cadena T delta se encuentran incluidos por entero dentro de la estructura de los
genes T alfa, entre los pools V y J. La activación del gen T alfa implica la necesaria
eliminación del gen T delta: durante el proceso de corte y empalme de segmentos
VJ en genes de cadena T alfa, el gen delta queda englobado y es escindido del genoma.
Los genes de cadenas T beta y gama, que estructuralmente son muy parecidos, se
ubican en Cr 7 muy cerca unos de otros (1-3,6).
En ambos tipos de receptores (BCR y TCR) los segmentos genéticos que
codifican para región variable preceden en el locus a los exones de regiones
constantes. Las cadenas pesadas de Ig y las cadenas T beta y delta tienen un
pool de segmentos genéticos Variables (V), Joint ( J) y Diverse (D). Las cadenas
livianas Kappa y Lambda y las cadenas T alfa y gamma carecen de regiones
D. Por lo tanto en cada heterodímero sea BCR o TCR se asocia una cadena
con región D con una cadena sin región D. Por otra parte parece ser que los
genes alfa y delta podrían compartir sus segmentos V. En realidad Diverse (D)
o “diverso” son segmentos genéticos propios de cadenas pesadas de Ig o cadenas
beta o gama de receptores T. En las cadenas livianas kappa/ Lambda o en sus
contrapartidas T alfa/delta no hay segmentos D.
Dada la particular configuración de los genes D para cadenas T delta y beta, es
posible que en algunos rearreglos se utilice más de un segmento D (1-3,6).
En los locus BCR humanos de Cadenas Pesadas hay 100 segmentos genéticos
de region variable (V), de 300 pb cada uno, separados entre si mediante cortos intervalos
intrónicos y organizados en 7 familias reconocibles en función de su grado
de homología. Hacia 5’ de cada exon V hay un exon que codifica un péptido señal
de iniciación de la traducción y un péptido líder que señaliza el tráfico intracelular
de la proteína de cadena pesada. Las secuencias codificadas por este exón no forman
parte de la estructura final del receptor. Además hay 30 regiones D ubicadas
a continuación de la región V (hacia 3’) que están agrupadas en 10 familias. Finalmente,
a continuación de los segmentos D se reconocen segmentos genéticos J y
luego un tandem de exones de región Constante (C) (1-3,6).
En los locus BCR humanos de Cadenas Livianas Kappa (Cr2) hay 76 segmentos
V agrupados en 6 familias, 5 segmentos funcionales J y sólo 1 gen C. En
locus de cadenas Lambda (Cr 22) hay 52 segmentos V agrupados en 10 familias y
7 genes C precedidos cada uno por un segmento J (hacia 5’).
En los locus T de cadena Beta hay dos genes C muy parecidos asociados con
un grupo de genes J y sólo un segmento D. Aquí se genera diversidad en el proceso
de unión dado que es posible que se generen rearreglos VDJ, VDDJ, VJ y por otra
parte que los segmentos D puedan ser leídos en tres diferentes marcos de lectura
(1-3). Puede también incrementar la diversidad el fenómeno de la inserción de
nucleótidos N en los sitios de unión V/D/J (ver más abajo).
Por otra parte es importante señalar que en los genes gama y delta hay muchos
menos segmentos V que en los genes alfa y beta. Como se ve, hay un estrecho paralelismo
estructural entre receptores B y T.
Los segmentos D, propios de cadenas pesadas, agregan una diversidad enorme a
la especificidad genética que aportan los segmentos V y J. La recombinación se inicia
con la fusión DJ y el segmento D puede unirse al segmento J en uno de tres marcos
de lectura. Sin embargo en la rata se han encontrado muy pocos segmentos D leídos
en marco 2 (Reading Frame 2 o RF2). A esto se le llama Contraselección RF2:
cuando DJ surge de RF2 codifica una forma trunca de cadena μ (Dμ) que cuando
se incorpora al complejo Igα/Igβ/λ5 y V-preB produce un Pre-BCR defectuoso que
inhibe la recombinación VDJ y bloquea la progresión madurativa del linaje B.
A pesar de esto la fusión DJ implica per se un alto grado de variabilidad (50).
Entonces para alcanzar un alto grado de diversidad alcanzaría con lo que
pudiere generar el arreglo VDJ de las cadenas pesadas. Pero las cadenas livianas
y las cadenas T alfa/delta incrementan la afinidad por el antígeno y sirven para
modificar receptores autoreactivos o defectuosos (1-3,6).
Una vez instalado en la membrana el receptor B comienza a ser sometido a
pruebas de calidad y sufre correcciones, es decir aparecen sucesivas “ediciones” de
receptor B (o T) que por lo general resultan de un proceso recombinatorio continuo
a nivel del locus de cadena liviana (10).
Esta parece ser la misión fundamental de las cadenas livianas: son correctores
de afinidad y modificadores de especificidad. Antes de que el sistema descarte
linfocitos por autoreactividad o por defecto funcional, el proceso recombinatorio
insiste en la búsqueda y recrea genes de cadena liviana para codificar nuevas combinaciones
con la cadena pesada ya instalada en la membrana. Si agota un locus pasa
al otro y finalmente prueba con los locus lambda (10).
Se trata de ediciones repetidas a partir de un esquema básico de reconocimiento
antigénico, esculpido en la región variable de la cadena pesada, que es corregido
mediante diferentes versiones de regiones variables de cadenas livianas. Pero el
resultado final será siempre un ensamble V(D)J-C de cadenas livianas y pesadas
originadas en rearreglos de locus singulares
A los linfocitos que superan la etapa de selección y permanecen vírgenes de
contacto antigénico se les llama Naif.
Una vez lograda una versión aceptable de su receptor, la célula B completa
su maduración y queda a la espera de un encuentro antigénico a nivel de Centros
Germinales de ganglios o bazo. Cuando esto ocurre se desencadena un activo proceso
de mutación en los genes V(D)J llamado hipermutación somática.
En la región Variable hay secuencias Hipervariables de AA llamadas Regiones
Determinantes de Complementaridad (CDR) CDR1, CDR2 y CDR3.
El dominio CDR3 de la región variable del TCR gama/delta se parece más a
su equivalente del BCR que al CDR3 del TCR alfa/beta. Por otra parte el TCR
gama/delta puede acomodar diferente tipo de antígenos y puede ligar antígenos de
manera directa sin la mediación de MHC. En definitiva, funcionalmente el TCR
gama/delta es muy parecido al BCR/Ig (1-3). Veremos más adelante que los receptores
T (TCR) αβ solo pueden reconcocer Antígenos (Ag) procesados en Células
Presentadoras de Ag y presentados en el surco de Moléculas del Complejo Mayor
de Histocompatibilidad (MHC) tipos I o II.
Las proteínas RAG y la recombinación VDJ
Decíamos que para armar un exon que codifique la región ligante de antígeno del
receptor B o T debe construirse un exon V(D)J a partir de pools de segmentos V,
D y J. Ya hemos aclarado que las cadenas Kappa, Lambda y T alfa o gamma solo
pueden crear exones VJ porque carecen de segmentos D.
La Recombinación VDJ es inducida mediante activación de los Genes Activadores
de la Recombinación (RAG). El locus de los genes RAG1 y RAG2,
ubicado en el Cromosoma 11p, está controlado por el Enhancer Erag y Factores
Transcripcionales de la familia E2A (49). Las proteínas RAG reconocen unas
secuencias de ADN que preceden y/o anteceden a cada uno de los segmentos
genéticos agrupados en tipos V,D yJ. A estas secuencias se las conoce como Secuencias
Señalizadoras de Recombinación (RSS). Estas secuencias consisten en
un Heptámero (CACAGTG) seguido por un intervalo no conservado que puede
tener 12 o 23 nucleótidos (X) y un Nonámero (ACAAAAACC). Las secuencias
de Nucleótidos de estos Heptámeros y Nonámeros son muy estables y afines a
dominios específicos ubicados en las proteínas RAG (6).
CACAGTGXXXXXXXXXXXXACAAAAACC
GTGTCACXXXXXXXXXXXXTGTTTTTGG
heptámero / espaciador de 12 / nonámero
RSS12
Secuencias Palindrómicas: obsérvese que el Heptámero es un arreglo Palindrómico,
dado que en una hebra la secuencia es CACAGTG y en la otra es GTGTCAC.
La Regla RSS 12/23
RSS12 y RSS23 abarcan respectivamente una y dos vueltas de hélice de ADN.
A cada segmento genético V,D o J le sigue y/o precede una secuencia RSS con
intervalo 12 o 23.
Acorde con la regla 12/23 dos RSS pueden aparearse solamente cuando los
intervalos espaciadores entre Hepatámero y Nonámero son 12 y 23. A esto se le
llama regla 12/23 o también regla de una y dos vueltas (12).
Quiere decir entonces que dos RSS de 12 o dos de 23 No pueden unirse. En
Cadenas Pesadas los segmentos V tienen RSS23 del lado 3’, los segmentos D tienen
RSS12 en ambos lados 5’ y 3’ y los segmentos J RSS23 del lado 5’. Dado que
J y V tienen RSS23 es imposible que un segmento J se una a un segmento V: son
incompatibles! En Cadenas Livianas Kappa los segmentos V tienen RSS12 y los
segmentos J RSS23. Ocurre a la inversa con Cadenas Livianas Lambda donde los
segmentos V tienen RSS23 y los J tienen RSS12.
En síntesis los segmentos genéticos V(D)J están acompañados siempre por una
de las dos variantes de RSS (12 o 23), de manera tal que sólo sean posibles combinaciones
ordenadas de un ejemplar de cada familia segmentos genéticos. Así se evita que
pueda generarse una combinación de dos segmentos J o en el caso de cadenas pesadas
de un segmento V con un J en lugar de la secuencia JD y luego VDJ (6,12,13).
Enzimas involucradas en la recombinación V(D)J
Las proteínas involucradas en el proceso de recombinación V(D)J pueden agruparse
en dos grandes grupos acorde con su nivel de restricción al sistema linfoide.
Las proteínas RAG1, RAG2 (6,13,14) y Deoxinucleotidil Transferasa Terminal
(TdT) se expresan exclusivamente en células linfoides (15,16). La actividad de
Recombinasa V(D)J está a cargo del complejo RAG1/RAG2 (6,13,14). La enzima
TdT no es esencial para la actividad catalitica, pero incrementa significativamente
la diversidad, mediando en la incorporación de AA “N” (16).
Las proteínas no restringidas a células linfoides, descritas hasta ahora, incluyen
a la Subunidad Catalítica de la Kinasa Dependiente de ADN (DNA-PKcs), al
heterodímero de unión al ADN Ku70/ Ku80, la proteína XRCC4, la DNA-ligasa
IV y la enzima Artemis (17, 18). Esta última, Artemis, interviene en la recombinación
V(D)J y la reparación de roturas dobles en el ADN. Fue originalmente descrita
en pacientes radiosensibles con deficiencia inmune (19). Artemis interactúa con
la DNA-PKcs, tiene actividad de nucleasa y sería responsable de la apertura de los
terminales codificantes “hairpin”. La deleción del gen Artemis ocasiona defectos
en la formación de uniones codificantes (coding joints), anomalías cromosomales
espontáneas, fusiones de telómeros e inestabilidad genómica. Todo este grupo de
proteínas, no linfoide específicas, participan en las etapas de procesamiento y unión
de la recombinación V(D)J (17-19).
Por otra parte, las proteínas HMG 1 y HMG 2, sigla del inglés para “grupo
de proteínas de alta movilidad”, tampoco son específicas de células linfoides, pero
intervienen también en los rearreglos V(D)J: HMG1 y 2 ayudan a torcer el ADN
y así incrementan la eficiencia de corte de las proteínas RAG (14, 20).
Una deficiencia en cualquiera de estos factores resulta en una recombinación
defectuosa, hipersensibilidad a la radiación ionizante y bloqueo precoz en el desarrollo
del sistema linfoide.
Interacción RAG / RSS
La proteína RAG1 tiene un dominio de unión a Nonámero (aa 390-469) que liga RSS12
o 23 con igual afinidad. El Heptámero contribuye en menor medida a la reacción. La
Proteína RAG2 hace mucho más estables los complejos RAG1/RSS12 o23 (6,14,18).
La recombinación V(D)J procede en dos etapas: una primer etapa de formación del
Complejo Sináptico y una segunda etapa de corte y fusión de segmentos codificantes.
En la 1er etapa las proteínas RAG eligen al azar dos segmentos genéticos con
secuencias RSS compatibles, siguiendo la regla 12/23. RAG1 se une al nonámero
de un RSS y luego RAG2 estabiliza el complejo a nivel del heptámero (6,14,18).
La formación del ensamble RAG1/Nonámero/Heptámero/RAG2 requiere
del espaciamiento adecuado que da la asociación RSS12 con RSS23 y la presencia
de cationes divalentes. Sobre cada segmento genético elegido para corte y empalme
se arma un complejo integrado por dímeros RAG1, tetrámeros RAG2 y las proteínas
de torsión del ADN HMG1 y HMG2. Ahora estos complejos proteicos
se atraen entre sí y ubican en paralelo, en extrema yuxtaposición o sinapsis, los
segmentos genéticos y sus respectivas secuencias RSS12 y RSS23. De esto resulta
el así llamado Complejo Sináptico (14,21).
En la 2da etapa se desarrolla el proceso de corte y empalme de las hebras de
ADN a nivel del límite entre la región codificante y las secuencias RSS. Aquí se
agregan al complejo una serie de proteínas específicas para tareas de corte y ensamble:
Ku70, Ku80, DNAPKcs, HRCC4, Ligasa IV, Artemis y TdT (17,18,19).
En este contexto las proteínas RAG insertan una muesca entre los heptámeros
de cada secuencia RSS y su región codificante, mediante una reacción de
hidrólisis que genera un terminal 3’ hidroxilo. Luego, respetando un mecanismo
de recombinación transposicional, el hidroxilo 3’ de la primer hebra seccionada es
utilizado para un ataque nucleofílico sobre la otra hebra. Como resultado ambas
hebras quedan selladas mediante uniones covalentes y adquieren la forma curva
de una hebilla (para el pelo). Por eso las terminales codificantes fueron bautizadas
“hairpin” (hairpin coding end). Quedan además dos terminales señal fosforiladas
en 5’. Los terminales señal son casi siempre de límite romo y no tienen ganancias
o pérdidas de nucleótidos (1-3,6,14-18).
Como resultado queda un Complejo Sináptico integrado por dos terminales
codificantes “hairpin” (coding end) y dos terminales RSS (signal end) y estos finalmente
son recombinados mediante mecanismos no homólogos de unión.
La apertura y procesamiento del “hairpin” del terminal codificante (coding end)
culmina en el exon de fusión (coding joint) y representa un paso crítico en la generación
de diversidad de unión. La DNA-PKcs desempeña un papel crítico tanto en la apertura
del hairpin como en la fusión de los coding ends. Las terminales RSS generan un
círculo que engloba y escinde el ADN intermedio (signal joints) (1-3,6,14-18).
Diversidad de Unión
El corte y empalme de la doble hebra de ADN, a nivel de las uniones VJ de cadenas livianas
y de las uniones DJ y VDJ de cadenas pesadas, es muy impreciso o variable. Dicha imprecisión
en las uniones agrega diversidad a la conformación de la 3er Región Determinante
de Complementaridad (CDR3) de las Regiones Variables de cadenas livianas y pesadas
(36). Por ejemplo, en la posición 96 de cadenas Kappa hay mucha variabilidad debido a
ligeras diferencias en la unión VJ y dicha posición cae precisamente en CDR3 (22).
La generación de diversidad de unión es iniciada con la apertura de los “hairpin”
en los terminales codificantes y la formación de hebras terminales abiertas y con
“flecos”. Estos terminales deflecados facilitan la adición de nucleótidos llamados
“N” por “no” respetar el molde marcado en el ADN germinal. De esta tarea diversificatoria
se encarga la Deoxinucleotidil Transferasa Terminal (TdT), que como
decíamos antes es específica de células linfoides. Esta ocasión deja también espacio
libre a extensiones de nucleótidos con secuencias palindrómicas, promovidas por
la DNA-Polimerasa (nucleótidos “P”). También ciertas nucleasas pueden provocar
deleciones de pequeños elementos codificantes. Es posible que ocurran además
fusiones no homólogas, regidas por microhomologías, entre cortos tramos de los
mencionados “flecos” de ADN. Como consecuencia de todo esto pueden quedar
intermediarios de recombinación que deben ser procesados mediante las proteínas
Artemis, RAG1/2 o el complejo MNR (Mre11, Rad50, NBS1) (17-19).
Adición de Nucleótidos “N”
El concepto de Diversidad de Región “N” se refiere a la adición de Nucleótidos que No respetan el molde del ADN original. A nivel de las uniones DJ y VD de cadenas pesadas pueden insertarse hasta 15 Nucleótidos “N” mediante la enzima Deoxinucleotidil transferasa terminal (tDt).
Adición de Nucleótidos “P”
Luego del corte de las hebras de ADN en las uniones codificantes pueden adicionarse cortas secuencias palindrómicas (“P”) y a este mecanismo se le llama adición de “P” Nucleótidos.
Deleción de Nucleótidos
Además también pueden ser removidos ciertos nucleótidos, previo al empalme, mediante una exonucleasa desconocida.
Diversidad Combinatoria
Hemos dicho que los genes de cadenas pesadas y livianas de Ig son re-arreglados en Cromosomas diferentes: Cr14 para Cadenas Pesadas y Cr 2 (Kappa) y Cr 22 (Lambda) para Cadenas Livianas. Estos exones transcriben luego RNA específico para cada una y luego de la traducción ribosomal pasan separadamente al Retículo Endoplásmico. Allí forman complejo con proteínas Chaperone para evitar su acople inapropiado con otras proteínas. Finalmente dos cadenas livianas de una misma especie, Kappa o Lambda, se unen al azar a cadenas pesadas y arman una molécula de Inmunoglobulina. Se genera así un nivel adicional de diversidad a raíz del azaroso encuentro entre cadenas livianas y pesadas (1-3).
Los conceptos de Diversificación Primaria y Secundaria
(Edición)
Los rearreglos en locus de cadenas pesadas y livianas culminan inicialmente
en exones VDJ de cadenas pesadas y VJ de cadenas livianas o sus equivalentes
en cadenas de TCR. Este sería un primer nivel de diversificación (Diversificación
Primaria) (1-3).
Una vez instalado en la membrana el receptor B o T es sometido a estrictos
controles de calidad. Las células que producen receptores eficientes e inocuos (no
autoreactivos) son incorporadas al repertorio de linfocitos B o T Naif y a esto se le
llama Selección Positiva (1-3). Las células que surgen con receptores defectuosos o
de insuficiente concentración a nivel de membrana, son sometidas a una segunda
línea de rearreglos, pero estos se producen exclusivamente en locus de cadenas
livianas o sus equivalentes T alfa o delta (26-27). Se observan aquí recombinaciones
que afectan segmentos V y J alternativos hacia 5’ y 3’ respectivamente. Estos son
rearreglos secundarios o ediciones del exon/receptor que resultara de la recombinación
primaria (Diversificación Secundaria) (10,23-27).
Mediante el proceso de edición es posible eliminar o inactivar genes V autoreactivos
y así generar auto-tolerancia. Pero a la vez, cuando ocurren rearreglos productivos
en alelos diferentes al que codifica un autoanticuerpo, la edición pone en
riesgo el principio de exclusión. Sin embargo es raro encontrar células B portadoras
de receptores múltiples o que segreguen más un anticuerpo (31). Las re-ediciones
de exones VJ pueden generar células B multi-reactivas que suelen ser parcialmente
autoreactivas. Esto mantiene activa la recombinación en locus de cadenas livianas
y puede conducir a la eliminación de los exones autoreactivos o a la apoptosis. Por
otra parte no todos los rearreglos productivos terminan instalados como receptores:
a esto se le llama “exclusión fenotipica”. Se han descrito células B auto-tolerantes
que expresan dos exones Kappa pero que a nivel de membrana solo muestran la
cadena capa correspondiente al exon editado. Sin embargo en zona marginal se han
descrito células B parcialmente auto-reactivas, que expresan receptores duales λ y
κ (31) y esto sería una violación al principio de exclusión clonal. De hecho se han
descrito linfocitos B con receptores de diferente reactividad (29).
También los eventos secundarios de recombinación T pueden producirse en
el otro alelo y esto puede conducir a una frecuencia relativamente alta de células
T que llegan a expresar dos tipos diferentes de cadenas alfa en sus receptores. En
realidad la frecuencia de rearreglos en el otro alelo alfa llega a 1/3 de las células T,
pero la cantidad de receptores con diferente reactividad es mucho más baja debido
a mecanismos postranscripcionales de exclusión alélica (30).
La biología de los rearreglos secundarios en células B y T es muy parecida.
Cuando los receptores B o T son eficientes y no autoreactivos emitirían una señal
constitutiva de baja intensidad, que provocaría represión de genes RAG: de
esta manera detendría la progresión de la actividad recombinatoria en los locus de
cadenas livianas o de sus equivalentes T alfa o delta. Esta señal debería ser contínua,
dado que su interrupción mediante anticuerpos anti-MHC resulta en una
reactivación de los genes RAG (10). Recordar que los receptores T son probados
contra Ag ubicados en el surco presentador de Moléculas del Complejo Mayor de
Histocompatibilidad (MHC). Cuando la reactividad entre el receptor y su Ag es
muy fuerte se produce un complejo que es internalizado para su degradación posterior.
Con la desaparición del receptor queda interrumpida la señal constitutiva
inhibitoria que bloquea la expresión de los genes RAG. Tampoco emiten señal
inhibitoria las células con baja concentración o disfunción de receptores. De una u
otra forma la supresión o agenesia de dicha señal implica la progresión de la actividad
recombinatoria a nivel de los locus de cadenas livianas o sus equivalentes en células T
(10). Si finalmente no es posible el desarrollo de receptores antigénicos eficientes, no
autoreactivos y en cantidad suficiente, la célula es eliminada (Selección Negativa).
Hipermutación Somática
Una vez re-arreglados los genes de línea germinal y diseñado el exon codificante puede
comenzar la transcripción, que culminara en la construcción de un Receptor Antigénico
definitivo. Mientras el linfocito B permanezca en estado virginal dicho receptor no
sufrirá modificaciones adicionales. Una vez puesto en contacto con un Antígeno afín,
en los Centros Germinales de Ganglio o Bazo, las Células T CD4+ (Helpers) promoverán
un intenso proceso de substituciones de pares de nucleótidos a nivel de los exones
codificantes de región variable para cadenas livianas y pesadas (32-35).
A este fenómeno se le llama Hipermutación Somática (HS) y resulta de mutaciones
puntuales que solo pueden ocurrir en exones ya re-arreglados, una vez desactivados
los genes RAG y silenciada la etapa recombinatoria de segmentos genéticos.
La intensidad de las mutaciones es aquí un millón de veces más intensa que la que
podría desencadenarse en línea germinal de manera espontánea. Mediante este recurso
los linfocitos “maduran la afinidad” de sus receptores (36). Por eso los linfocitos B
que se aislan en función de su reactividad ante un mismo determinante antigénico
suelen presentar un amplio espectro de afinidades. El Sistema Inmune selecciona,
para su diferenciación a Células Plasmaticas o B Memoria, aquellos linfocitos B que
despliegan mayor afinidad frente a limitadas cantidades de Ag expuesto en la superficie
de las Células Dendríticas en los Centros Germinales (CG) (32-35).
La etapa de HS coincide con un significativo incremento en la producción de
Citidin Deaminasa Inducida por Activación de Linfocitos B (AID). Esta enzima
induce mutaciones en genes re-arreglados de Región Variable, exclusivamente en
linfocitos B, mediante conversión de Deoxicitidina en Deoxiuridina (32-35).
Recombinación para Cambio de Clase de Inmunoglobulinas
(CSR)
Casi simultáneamente con la HS comienza el Cambio de Clase de Igs, Class Switch
Recombination o CSR que es el recambio de regiones constantes en los genes
recombinados de Inmunoglobulinas. El CSR es un proceso que permite diversificar
la función efectora de las Igs mediante conversión de regiones constantes de
cadenas pesadas de Cμ a Cγ, Cα o Cε. Acorde con los requerimientos funcionales
las IgM/IgD cambian de Clase a IgG, IgA, IgE y subtipos (1-3, 35).
Los procesos de Hipermutación Somática y Cambio de Clase de Ig son exclusivos
de Célula B y solo pueden activarse cuando la tarea de recombinación genética
ha concluido. Estos fenómenos se producen a nivel de los Centros Germinales en
Ganglios o Bazo y son dependientes de la interacción entre células B y T (1-3,35).
El CSR es similar a la recombinación V(D)J en dos aspectos: implica roturas
de doble hebra y fusiones dependientes de un Sistema No Homólogo de Reparación
de Terminales Cortados (NHEJ) (38).
El locus de segmentos Constantes de Cadenas Pesadas (CH) está constituido
por una serie de genes CH, cada uno precedido (en 5’) por una región “cambio” o
“switch” (S). El CSR ocurre entre dos regiones S caracterizadas por tandems repetitivos
de secuencias palindrómicas. Dado que el gen Cμ es proximal al exón VH,
el CSR entre Sμ y alguna otra región S (ε,α,γ) provocará el reemplazo del Cμ por
el CH correspondiente. El CSR culmina en el reemplazo del exon Cμ por alguno
de los segmentos constantes pesados (CH) ubicados corriente abajo. Para esto se
requiere la deleción del ADN intermedio entre dichos segmentos y la producción
de ADN Circular como subproducto de escisión (1-3,37,38).
Cada región S contiene secuencias pentaméricas ricas en Guanidin Nucleótidos,
pero la exacta secuencia primaria varía mucho de una a otra. En la rata las
secuencias S abarcan repeticiones de 49 pb en Sγ, 40 pb en Sε, 80 pb Sα, etc, pero
algo similar ocurre en otras especies, incluyendo humanos. Cuando el ADN es
desnaturalizado, las secuencias palindrómicas de estas regiones switch (S) pueden
formar estructuras espontáneas tipo asas o círculos de ADN. La ausencia de este
tipo de secuencias anula el CSR por completo (37,38).
Desempeñan aquí un rol muy importante las IL-4 e IL-5. La estimulación
por estas citokinas induce la transcripción de ADN germinal desde un promotor
intrónico ubicado a 5’ de cada región Switch (S) y la síntesis de novo de CSR
recombinasa o quizás la síntesis de su activador (52). Por otra parte la activación
de la transcripción a nivel de las regiones S facilita per se a la recombinasa CSR su
acceso a las mismas (37,38).
La recombinasa CSR no sólo reconoce la secuencia primaria de las regiones S
sino que también reconoce su estructura secundaria. La transcripción de regiones S
con orientación opuesta a veces genera CSR de tipo invertido en lugar de tipo delecional.
Por otra parte la eficiencia de la recombinación se correlaciona de manera
positiva con la actividad transcripcional y esto sugiere la existencia de una asociación
entre las maquinarias al servicio de ambos procesos. La transcripción abre transitoriamente
las hebras de ADN e induce la formación de plegamientos de hebra simple
(sobre sí mismas) que generan estructuras símil asa (a la manera de un lazo).
Estas estructuras secundarias, con forma de “chupetín”, son reconocibles por
la CSR recombinasa y resultan de interacciones complementarias entre secuencias
palindrómicas de regiones Switch (S) de una hebra singular.
Deaminasa Inducible por Activación (AID)
La activación de CSR coincide con la expresión de una enzima llamada AID por
Citidin Deaminasa Inducible por Activación (de CSR). AID es una proteína
indispensable para la diversificación de los genes de Ig, para la maduración de la
afinidad (HS) y para la determinación del destino funcional de las Ig (CSR). AID
conforma un tetrámero que sólo puede desaminar citidinas en moléculas de ADN
y no es activa sobre ARN. Solamente puede unirse a hebras simples de ADN
y esto remarca la estrecha vinculación existente entre hipermutación somática y
transcripción (33,34).
La enzima AID se expresa específicamente en Células B cuando estas toman
contacto con su Ag en los Centros Germinales del tejido linfoide. Pero AID interviene
tanto en CSR como SH a pesar de tratarse de procesos totalmente diferentes.
En pacientes con Síndrome de Hiper-IgM tipo II se han identificado mutaciones
en el gen de esta enzima AID. Probablemente AID intervendría en un proceso de
corte de hebras de ADN que sería común tanto a CSR como a HS (33,34,39).
La expresión ectópica de AID induce HS y CSR en células no B como
Fibroblastos y Células T. Todo esto demuestra que AID es esencial y suficiente
para dos alteraciones genéticas diferentes inducibles por estimulación antigénica
de Células B de mamíferos.
La expresión de AID está restringida a los Centros Germinales. Los animales
transgénicos deficientes en AID no pueden producir IgG, IgA o IgE pero sí pueden
fabricar excesos de IgM aunque no hayan sido inmunizados. En el Síndrome
de Hiper-IgM ligado al CrX (tipo 1) el fenómeno es similar y se debe a defectos en
CSR por mutación en el gen del CD40L. Una variante (tipo 2) de este síndrome se
debe a mutaciones en el gen que codifica la enzima AID (Cr12p13). Los pacientes
con esta variante de Síndrome de Hiper-IgM carecen también de Hipermutación
Somática pero tienen recombinación V(D)J normal (37-40).
El desarrollo de Linfocitos B depende en gran medida de la indemnidad de los CG
Los animales con “Alinfoplasia” (Aly) se caracterizan por una mutación que afecta el dominio de interacción con Linfokina Beta de la Kinasa Inductora de NFkB (NIK) (43). En estos animales la Linfokina B no puede activar a la kinasa NIK y esta entonces no puede liberar NFkB. Queda de esta manera bloqueado el desarrollo de Nódulos Linfáticos y Placas de Peyer y en el Bazo se evidencian severas alteraciones estructurales (42,43). En los ratones transgénicos que presentan esta
mutación, tanto la HS como la CSR están severamente dañadas. Los animales deficientes en Linfotokina alfa y TNF alfa también presentan defectos en la estructura de sus Folículos Linofoides y alteraciones en HS y CSR (45,46).
Queda claro entonces que los CG son estructuras casi imprescindibles para un desarrollo normal de Células B. Pero hay excepciones a la regla. La IgG3 que se forma en la Zona Marginal de ganglios o bazo y gran parte de la IgA que se produce en intestino, responde a estimulación antigénica independiente de Linfocitos T. Por otra parte ha sido demostrado que las Células B pueden se sometidas a HS y CSR en la pared intestinal (lamina propria) (47). Mediante hiperinmunización es posible inducir HS y CSR en animales Aly/Aly, LTalfa -/- y Lyn -/- caracterizados por formación
defectuosa de CG. También es posible detectar un cierto grado de HS en linfocitos B de enfermos que padecen Síndrome de Hiper-IgM tipo I, provocado por mutaciones en el Ligante de CD40, caracterizado precisamente por carencia de CG (45-47).
En definitiva, el ámbito del CG favorece los fenómenos de HS y CSR pero no es exclusivo.
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Eritroferon S.R.L., 2011.
ISBN 978-987-27121-0-5
Ricardo Antonio Giuliani
Las Células B y T completan su ciclo madurativo cuando logran instalar en su membrana
receptores antigénicos de exclusiva afinidad antigénica. Si producen versiones
defectuosas o autoractivas y no pueden corregirlas van a la apoptosis (1-3).
Una vez alcanzada su madurez la viabilidad de un linfocito depende en gran
medida de la integridad de sus receptores antigénicos. La mayor parte de los recursos
de un linfocito está al servicio de sus receptores B (BCR) o T (TCR).
La ablación experimental de los receptores B activa de inmediato la maquinaria
de apoptosis en cualquier etapa de su desarrollo (4) y lo mismo parece ocurrir en
células T CD8+. Por el contrario, las células T CD4+ que pierden sus TCR permanecen
viables durante largos períodos de tiempo (5).
La región de interacción con antígenos, en receptores B o T, despliega un alto grado
de variación en secuencias de AA. Por eso es conocida como (“Variable”). Para construir
esta región Variable las células disponen de un extenso catálogo de segmentos genéticos
agrupados en tres familias diferentes: Variable (V), Diverso (D) y Joint (J) (1-3).
En el curso de su diferenciación los linfocitos eligen al azar un ejemplar de cada
familia y así construyen un exon codificante de región variable, con afinidad específica
para una determinada estructura molecular. Al proceso que conduce a la creación de este
exon de fusión se le llama recombinación V(D)J. La D aparece entre paréntesis porque
los locus de cadenas livianas o cadenas T alfa y gama carecen de segmentos D (6).
Los re-arreglos V(D)J resultan en más de un millón de variantes, ergo es difícil
que dos linfocitos Naif exhiban receptores de similar afinidad antigénica. Por eso
el Sistema Inmune Adaptativo está virtualmente capacitado para responder contra
todo tipo de Antígeno concebible (1-3).
La recombinación V(D)J es un evento complejo y muy regulado que puede
abarcar más de una megabase y responde a patrones específicos de linaje celular y
estadio de desarrollo (1-3,6).
Los segmentos V(D)J son móviles y tienen jerarquía de transposones. De hecho las
proteínas que cargan con la mayor responsabilidad en los rearreglos de línea germinal, las
proteínas activadoras de la recombinasa (RAG), tienen función de transposasas (6,7,11).
Transposones son secuencias de DNA que pueden “translocarse” de un sitio
otro del genoma dentro de una misma célula. Por eso estos genes también fueron
llamados “genes saltadores” y constituyen ejemplos de elementos genéticos móviles.
Los “retrotransposones” pueden ser transcriptos a RNA, readquirir conformación
de DNA y reinsertarse en el genoma mediante transcriptasa reversa. Los
transposones pueden moverse dentro del genoma de manera directa, sin copiarse
a RNA. Para esto cuentan con una transposasa apta para extirparlos de un sitio
y reinstalarlos en otro.
El fenómeno de Exclusión Alélica
La expresión genética de los receptores antigénicos es necesariamente Monoalélica. Si
se re-arreglaran al azar los segmentos genéticos de los dos alelos de cadenas pesadas y
los cuatro alelos de cadenas livianas o sus equivalentes en cadenas T, resultarían receptores
de diversa afinidad antigénica y se violaría el principio de diversificación clonal.
Para evitar esto las células B y T cuentan con mecanismos de Exclusión Alélica: la
activación de un alelo implica el automático silenciamiento de los otros (1-3,8,9).
Característicamente, las cadenas pesadas o sus contrapartidas beta/gama en células
T, sirven para construir el eje del receptor antigénico. Una vez completado el
armado del gen de cadena pesada en un cromosoma, el proceso recombinatorio de
cadena pesada o beta/gamma de su homólogo queda silenciado definitivamente. Luego
se inicia la construcción de cadenas livianas, siempre en uno de los locus parentales.
Mientras esté activo uno de los locus los otros tres locus, es decir el otro locus kappa
y los dos locus lambda, permanecen inactivos (excluidos). Como resultado se produce
una cadena liviana que reemplaza a la subrogante en el complejo con cadena pesada.
Para iniciar su diferenciación el Linfocito B debe activar el locus genético de
Cadena Pesada de un solo Cromosoma (Cr). La activación del alelo de cadena
pesada en Cr 14 paterno implica el inexorable silenciamiento del Cr 14 materno.
Una vez producida la proteína de cadena pesada e instalada en la membrana, se inicia
la activación de un solo locus de cadena liviana Kappa en Cr 2 (materno o paterno).
Si no puede generar una cadena liviana apta para el armado de su receptor, pasa
al otro alelo Kappa y finalmente, si fracasa, lo vuelve a intentar con los locus de
cadena Lambda en Cr22, probando siempre primero con uno y luego con el otro.
La activación de los genes que codifican receptores T sigue una secuencia similar
(1-3, 8). Sin embargo veremos más adelante que el principio de exclusión alélica es
frecuentemente violado tanto en células T como B (29-31).
Siguiendo con las excepciones, es interesante señalar que un 15% de las células
ProB normales de ratón culmina los rearreglos de cadena liviana antes de completar
los rearreglos de cadenas pesadas (51).
Los Locus B de cadenas pesadas y livianas y sus equivalentes en Células T
En los receptores antigénicos se reconoce una región que tiene una secuencia de
aminoácidos (AA) muy Variable entre cada linfocito que completa su maduración.
Es esta secuencia la que determina el idiotipo del clon. El resto del receptor, dentro
de las características estructurales propias de cada versión B o T, varía muy poco
en secuencia de AA y por eso es conocido como región constante. Estas regiones
Variable y Constante caracterizan tanto a cadenas livianas como pesadas. Las clases
y subclases de Ig estan determinadas por el tipo de cadena pesada. El tipo de región
constante determina el isotipo (IgM, IgG, IgE, IgA) de Inmunoglobulina (1-3).
El receptor T (TCR) resulta de la combinación de cadenas alfa/beta o gamma/
delta. Más del 95% de losTCR son alfa/beta. En estos receptores las cadenas beta
y delta tienen una estructura parecida a las cadenas pesadas de Ig y las cadenas alfa
y gamma una estructura similar a las cadenas livianas de Ig. En estas moléculas se
identifica también una región variable y una región constante. El TCR está diseñado
para actuar exclusivamente a nivel de superficie celular (1-3).
El BCR funciona inicialmente como receptor y permanece anclado a la membrana
mediante una estructura hidrofóbica. Cuando alcanza un nivel óptimo de afinidad
por el antígeno y cambia su región constante de cadena pesada acorde con su destino
funcional, la célula comienza a segregarlo como inmunoglobulina (Ig). Una Ig es un
receptor B que carece de su región hidrofóbica: es la expresión soluble del BCR (1-3).
Las cadenas T alfa y delta se arman en Cr14. Los segmentos genéticos V/J de
cadena T delta se encuentran incluidos por entero dentro de la estructura de los
genes T alfa, entre los pools V y J. La activación del gen T alfa implica la necesaria
eliminación del gen T delta: durante el proceso de corte y empalme de segmentos
VJ en genes de cadena T alfa, el gen delta queda englobado y es escindido del genoma.
Los genes de cadenas T beta y gama, que estructuralmente son muy parecidos, se
ubican en Cr 7 muy cerca unos de otros (1-3,6).
En ambos tipos de receptores (BCR y TCR) los segmentos genéticos que
codifican para región variable preceden en el locus a los exones de regiones
constantes. Las cadenas pesadas de Ig y las cadenas T beta y delta tienen un
pool de segmentos genéticos Variables (V), Joint ( J) y Diverse (D). Las cadenas
livianas Kappa y Lambda y las cadenas T alfa y gamma carecen de regiones
D. Por lo tanto en cada heterodímero sea BCR o TCR se asocia una cadena
con región D con una cadena sin región D. Por otra parte parece ser que los
genes alfa y delta podrían compartir sus segmentos V. En realidad Diverse (D)
o “diverso” son segmentos genéticos propios de cadenas pesadas de Ig o cadenas
beta o gama de receptores T. En las cadenas livianas kappa/ Lambda o en sus
contrapartidas T alfa/delta no hay segmentos D.
Dada la particular configuración de los genes D para cadenas T delta y beta, es
posible que en algunos rearreglos se utilice más de un segmento D (1-3,6).
En los locus BCR humanos de Cadenas Pesadas hay 100 segmentos genéticos
de region variable (V), de 300 pb cada uno, separados entre si mediante cortos intervalos
intrónicos y organizados en 7 familias reconocibles en función de su grado
de homología. Hacia 5’ de cada exon V hay un exon que codifica un péptido señal
de iniciación de la traducción y un péptido líder que señaliza el tráfico intracelular
de la proteína de cadena pesada. Las secuencias codificadas por este exón no forman
parte de la estructura final del receptor. Además hay 30 regiones D ubicadas
a continuación de la región V (hacia 3’) que están agrupadas en 10 familias. Finalmente,
a continuación de los segmentos D se reconocen segmentos genéticos J y
luego un tandem de exones de región Constante (C) (1-3,6).
En los locus BCR humanos de Cadenas Livianas Kappa (Cr2) hay 76 segmentos
V agrupados en 6 familias, 5 segmentos funcionales J y sólo 1 gen C. En
locus de cadenas Lambda (Cr 22) hay 52 segmentos V agrupados en 10 familias y
7 genes C precedidos cada uno por un segmento J (hacia 5’).
En los locus T de cadena Beta hay dos genes C muy parecidos asociados con
un grupo de genes J y sólo un segmento D. Aquí se genera diversidad en el proceso
de unión dado que es posible que se generen rearreglos VDJ, VDDJ, VJ y por otra
parte que los segmentos D puedan ser leídos en tres diferentes marcos de lectura
(1-3). Puede también incrementar la diversidad el fenómeno de la inserción de
nucleótidos N en los sitios de unión V/D/J (ver más abajo).
Por otra parte es importante señalar que en los genes gama y delta hay muchos
menos segmentos V que en los genes alfa y beta. Como se ve, hay un estrecho paralelismo
estructural entre receptores B y T.
Los segmentos D, propios de cadenas pesadas, agregan una diversidad enorme a
la especificidad genética que aportan los segmentos V y J. La recombinación se inicia
con la fusión DJ y el segmento D puede unirse al segmento J en uno de tres marcos
de lectura. Sin embargo en la rata se han encontrado muy pocos segmentos D leídos
en marco 2 (Reading Frame 2 o RF2). A esto se le llama Contraselección RF2:
cuando DJ surge de RF2 codifica una forma trunca de cadena μ (Dμ) que cuando
se incorpora al complejo Igα/Igβ/λ5 y V-preB produce un Pre-BCR defectuoso que
inhibe la recombinación VDJ y bloquea la progresión madurativa del linaje B.
A pesar de esto la fusión DJ implica per se un alto grado de variabilidad (50).
Entonces para alcanzar un alto grado de diversidad alcanzaría con lo que
pudiere generar el arreglo VDJ de las cadenas pesadas. Pero las cadenas livianas
y las cadenas T alfa/delta incrementan la afinidad por el antígeno y sirven para
modificar receptores autoreactivos o defectuosos (1-3,6).
Una vez instalado en la membrana el receptor B comienza a ser sometido a
pruebas de calidad y sufre correcciones, es decir aparecen sucesivas “ediciones” de
receptor B (o T) que por lo general resultan de un proceso recombinatorio continuo
a nivel del locus de cadena liviana (10).
Esta parece ser la misión fundamental de las cadenas livianas: son correctores
de afinidad y modificadores de especificidad. Antes de que el sistema descarte
linfocitos por autoreactividad o por defecto funcional, el proceso recombinatorio
insiste en la búsqueda y recrea genes de cadena liviana para codificar nuevas combinaciones
con la cadena pesada ya instalada en la membrana. Si agota un locus pasa
al otro y finalmente prueba con los locus lambda (10).
Se trata de ediciones repetidas a partir de un esquema básico de reconocimiento
antigénico, esculpido en la región variable de la cadena pesada, que es corregido
mediante diferentes versiones de regiones variables de cadenas livianas. Pero el
resultado final será siempre un ensamble V(D)J-C de cadenas livianas y pesadas
originadas en rearreglos de locus singulares
A los linfocitos que superan la etapa de selección y permanecen vírgenes de
contacto antigénico se les llama Naif.
Una vez lograda una versión aceptable de su receptor, la célula B completa
su maduración y queda a la espera de un encuentro antigénico a nivel de Centros
Germinales de ganglios o bazo. Cuando esto ocurre se desencadena un activo proceso
de mutación en los genes V(D)J llamado hipermutación somática.
En la región Variable hay secuencias Hipervariables de AA llamadas Regiones
Determinantes de Complementaridad (CDR) CDR1, CDR2 y CDR3.
El dominio CDR3 de la región variable del TCR gama/delta se parece más a
su equivalente del BCR que al CDR3 del TCR alfa/beta. Por otra parte el TCR
gama/delta puede acomodar diferente tipo de antígenos y puede ligar antígenos de
manera directa sin la mediación de MHC. En definitiva, funcionalmente el TCR
gama/delta es muy parecido al BCR/Ig (1-3). Veremos más adelante que los receptores
T (TCR) αβ solo pueden reconcocer Antígenos (Ag) procesados en Células
Presentadoras de Ag y presentados en el surco de Moléculas del Complejo Mayor
de Histocompatibilidad (MHC) tipos I o II.
Las proteínas RAG y la recombinación VDJ
Decíamos que para armar un exon que codifique la región ligante de antígeno del
receptor B o T debe construirse un exon V(D)J a partir de pools de segmentos V,
D y J. Ya hemos aclarado que las cadenas Kappa, Lambda y T alfa o gamma solo
pueden crear exones VJ porque carecen de segmentos D.
La Recombinación VDJ es inducida mediante activación de los Genes Activadores
de la Recombinación (RAG). El locus de los genes RAG1 y RAG2,
ubicado en el Cromosoma 11p, está controlado por el Enhancer Erag y Factores
Transcripcionales de la familia E2A (49). Las proteínas RAG reconocen unas
secuencias de ADN que preceden y/o anteceden a cada uno de los segmentos
genéticos agrupados en tipos V,D yJ. A estas secuencias se las conoce como Secuencias
Señalizadoras de Recombinación (RSS). Estas secuencias consisten en
un Heptámero (CACAGTG) seguido por un intervalo no conservado que puede
tener 12 o 23 nucleótidos (X) y un Nonámero (ACAAAAACC). Las secuencias
de Nucleótidos de estos Heptámeros y Nonámeros son muy estables y afines a
dominios específicos ubicados en las proteínas RAG (6).
CACAGTGXXXXXXXXXXXXACAAAAACC
GTGTCACXXXXXXXXXXXXTGTTTTTGG
heptámero / espaciador de 12 / nonámero
RSS12
Secuencias Palindrómicas: obsérvese que el Heptámero es un arreglo Palindrómico,
dado que en una hebra la secuencia es CACAGTG y en la otra es GTGTCAC.
La Regla RSS 12/23
RSS12 y RSS23 abarcan respectivamente una y dos vueltas de hélice de ADN.
A cada segmento genético V,D o J le sigue y/o precede una secuencia RSS con
intervalo 12 o 23.
Acorde con la regla 12/23 dos RSS pueden aparearse solamente cuando los
intervalos espaciadores entre Hepatámero y Nonámero son 12 y 23. A esto se le
llama regla 12/23 o también regla de una y dos vueltas (12).
Quiere decir entonces que dos RSS de 12 o dos de 23 No pueden unirse. En
Cadenas Pesadas los segmentos V tienen RSS23 del lado 3’, los segmentos D tienen
RSS12 en ambos lados 5’ y 3’ y los segmentos J RSS23 del lado 5’. Dado que
J y V tienen RSS23 es imposible que un segmento J se una a un segmento V: son
incompatibles! En Cadenas Livianas Kappa los segmentos V tienen RSS12 y los
segmentos J RSS23. Ocurre a la inversa con Cadenas Livianas Lambda donde los
segmentos V tienen RSS23 y los J tienen RSS12.
En síntesis los segmentos genéticos V(D)J están acompañados siempre por una
de las dos variantes de RSS (12 o 23), de manera tal que sólo sean posibles combinaciones
ordenadas de un ejemplar de cada familia segmentos genéticos. Así se evita que
pueda generarse una combinación de dos segmentos J o en el caso de cadenas pesadas
de un segmento V con un J en lugar de la secuencia JD y luego VDJ (6,12,13).
Enzimas involucradas en la recombinación V(D)J
Las proteínas involucradas en el proceso de recombinación V(D)J pueden agruparse
en dos grandes grupos acorde con su nivel de restricción al sistema linfoide.
Las proteínas RAG1, RAG2 (6,13,14) y Deoxinucleotidil Transferasa Terminal
(TdT) se expresan exclusivamente en células linfoides (15,16). La actividad de
Recombinasa V(D)J está a cargo del complejo RAG1/RAG2 (6,13,14). La enzima
TdT no es esencial para la actividad catalitica, pero incrementa significativamente
la diversidad, mediando en la incorporación de AA “N” (16).
Las proteínas no restringidas a células linfoides, descritas hasta ahora, incluyen
a la Subunidad Catalítica de la Kinasa Dependiente de ADN (DNA-PKcs), al
heterodímero de unión al ADN Ku70/ Ku80, la proteína XRCC4, la DNA-ligasa
IV y la enzima Artemis (17, 18). Esta última, Artemis, interviene en la recombinación
V(D)J y la reparación de roturas dobles en el ADN. Fue originalmente descrita
en pacientes radiosensibles con deficiencia inmune (19). Artemis interactúa con
la DNA-PKcs, tiene actividad de nucleasa y sería responsable de la apertura de los
terminales codificantes “hairpin”. La deleción del gen Artemis ocasiona defectos
en la formación de uniones codificantes (coding joints), anomalías cromosomales
espontáneas, fusiones de telómeros e inestabilidad genómica. Todo este grupo de
proteínas, no linfoide específicas, participan en las etapas de procesamiento y unión
de la recombinación V(D)J (17-19).
Por otra parte, las proteínas HMG 1 y HMG 2, sigla del inglés para “grupo
de proteínas de alta movilidad”, tampoco son específicas de células linfoides, pero
intervienen también en los rearreglos V(D)J: HMG1 y 2 ayudan a torcer el ADN
y así incrementan la eficiencia de corte de las proteínas RAG (14, 20).
Una deficiencia en cualquiera de estos factores resulta en una recombinación
defectuosa, hipersensibilidad a la radiación ionizante y bloqueo precoz en el desarrollo
del sistema linfoide.
Interacción RAG / RSS
La proteína RAG1 tiene un dominio de unión a Nonámero (aa 390-469) que liga RSS12
o 23 con igual afinidad. El Heptámero contribuye en menor medida a la reacción. La
Proteína RAG2 hace mucho más estables los complejos RAG1/RSS12 o23 (6,14,18).
La recombinación V(D)J procede en dos etapas: una primer etapa de formación del
Complejo Sináptico y una segunda etapa de corte y fusión de segmentos codificantes.
En la 1er etapa las proteínas RAG eligen al azar dos segmentos genéticos con
secuencias RSS compatibles, siguiendo la regla 12/23. RAG1 se une al nonámero
de un RSS y luego RAG2 estabiliza el complejo a nivel del heptámero (6,14,18).
La formación del ensamble RAG1/Nonámero/Heptámero/RAG2 requiere
del espaciamiento adecuado que da la asociación RSS12 con RSS23 y la presencia
de cationes divalentes. Sobre cada segmento genético elegido para corte y empalme
se arma un complejo integrado por dímeros RAG1, tetrámeros RAG2 y las proteínas
de torsión del ADN HMG1 y HMG2. Ahora estos complejos proteicos
se atraen entre sí y ubican en paralelo, en extrema yuxtaposición o sinapsis, los
segmentos genéticos y sus respectivas secuencias RSS12 y RSS23. De esto resulta
el así llamado Complejo Sináptico (14,21).
En la 2da etapa se desarrolla el proceso de corte y empalme de las hebras de
ADN a nivel del límite entre la región codificante y las secuencias RSS. Aquí se
agregan al complejo una serie de proteínas específicas para tareas de corte y ensamble:
Ku70, Ku80, DNAPKcs, HRCC4, Ligasa IV, Artemis y TdT (17,18,19).
En este contexto las proteínas RAG insertan una muesca entre los heptámeros
de cada secuencia RSS y su región codificante, mediante una reacción de
hidrólisis que genera un terminal 3’ hidroxilo. Luego, respetando un mecanismo
de recombinación transposicional, el hidroxilo 3’ de la primer hebra seccionada es
utilizado para un ataque nucleofílico sobre la otra hebra. Como resultado ambas
hebras quedan selladas mediante uniones covalentes y adquieren la forma curva
de una hebilla (para el pelo). Por eso las terminales codificantes fueron bautizadas
“hairpin” (hairpin coding end). Quedan además dos terminales señal fosforiladas
en 5’. Los terminales señal son casi siempre de límite romo y no tienen ganancias
o pérdidas de nucleótidos (1-3,6,14-18).
Como resultado queda un Complejo Sináptico integrado por dos terminales
codificantes “hairpin” (coding end) y dos terminales RSS (signal end) y estos finalmente
son recombinados mediante mecanismos no homólogos de unión.
La apertura y procesamiento del “hairpin” del terminal codificante (coding end)
culmina en el exon de fusión (coding joint) y representa un paso crítico en la generación
de diversidad de unión. La DNA-PKcs desempeña un papel crítico tanto en la apertura
del hairpin como en la fusión de los coding ends. Las terminales RSS generan un
círculo que engloba y escinde el ADN intermedio (signal joints) (1-3,6,14-18).
Diversidad de Unión
El corte y empalme de la doble hebra de ADN, a nivel de las uniones VJ de cadenas livianas
y de las uniones DJ y VDJ de cadenas pesadas, es muy impreciso o variable. Dicha imprecisión
en las uniones agrega diversidad a la conformación de la 3er Región Determinante
de Complementaridad (CDR3) de las Regiones Variables de cadenas livianas y pesadas
(36). Por ejemplo, en la posición 96 de cadenas Kappa hay mucha variabilidad debido a
ligeras diferencias en la unión VJ y dicha posición cae precisamente en CDR3 (22).
La generación de diversidad de unión es iniciada con la apertura de los “hairpin”
en los terminales codificantes y la formación de hebras terminales abiertas y con
“flecos”. Estos terminales deflecados facilitan la adición de nucleótidos llamados
“N” por “no” respetar el molde marcado en el ADN germinal. De esta tarea diversificatoria
se encarga la Deoxinucleotidil Transferasa Terminal (TdT), que como
decíamos antes es específica de células linfoides. Esta ocasión deja también espacio
libre a extensiones de nucleótidos con secuencias palindrómicas, promovidas por
la DNA-Polimerasa (nucleótidos “P”). También ciertas nucleasas pueden provocar
deleciones de pequeños elementos codificantes. Es posible que ocurran además
fusiones no homólogas, regidas por microhomologías, entre cortos tramos de los
mencionados “flecos” de ADN. Como consecuencia de todo esto pueden quedar
intermediarios de recombinación que deben ser procesados mediante las proteínas
Artemis, RAG1/2 o el complejo MNR (Mre11, Rad50, NBS1) (17-19).
Adición de Nucleótidos “N”
El concepto de Diversidad de Región “N” se refiere a la adición de Nucleótidos que No respetan el molde del ADN original. A nivel de las uniones DJ y VD de cadenas pesadas pueden insertarse hasta 15 Nucleótidos “N” mediante la enzima Deoxinucleotidil transferasa terminal (tDt).
Adición de Nucleótidos “P”
Luego del corte de las hebras de ADN en las uniones codificantes pueden adicionarse cortas secuencias palindrómicas (“P”) y a este mecanismo se le llama adición de “P” Nucleótidos.
Deleción de Nucleótidos
Además también pueden ser removidos ciertos nucleótidos, previo al empalme, mediante una exonucleasa desconocida.
Diversidad Combinatoria
Hemos dicho que los genes de cadenas pesadas y livianas de Ig son re-arreglados en Cromosomas diferentes: Cr14 para Cadenas Pesadas y Cr 2 (Kappa) y Cr 22 (Lambda) para Cadenas Livianas. Estos exones transcriben luego RNA específico para cada una y luego de la traducción ribosomal pasan separadamente al Retículo Endoplásmico. Allí forman complejo con proteínas Chaperone para evitar su acople inapropiado con otras proteínas. Finalmente dos cadenas livianas de una misma especie, Kappa o Lambda, se unen al azar a cadenas pesadas y arman una molécula de Inmunoglobulina. Se genera así un nivel adicional de diversidad a raíz del azaroso encuentro entre cadenas livianas y pesadas (1-3).
Los conceptos de Diversificación Primaria y Secundaria
(Edición)
Los rearreglos en locus de cadenas pesadas y livianas culminan inicialmente
en exones VDJ de cadenas pesadas y VJ de cadenas livianas o sus equivalentes
en cadenas de TCR. Este sería un primer nivel de diversificación (Diversificación
Primaria) (1-3).
Una vez instalado en la membrana el receptor B o T es sometido a estrictos
controles de calidad. Las células que producen receptores eficientes e inocuos (no
autoreactivos) son incorporadas al repertorio de linfocitos B o T Naif y a esto se le
llama Selección Positiva (1-3). Las células que surgen con receptores defectuosos o
de insuficiente concentración a nivel de membrana, son sometidas a una segunda
línea de rearreglos, pero estos se producen exclusivamente en locus de cadenas
livianas o sus equivalentes T alfa o delta (26-27). Se observan aquí recombinaciones
que afectan segmentos V y J alternativos hacia 5’ y 3’ respectivamente. Estos son
rearreglos secundarios o ediciones del exon/receptor que resultara de la recombinación
primaria (Diversificación Secundaria) (10,23-27).
Mediante el proceso de edición es posible eliminar o inactivar genes V autoreactivos
y así generar auto-tolerancia. Pero a la vez, cuando ocurren rearreglos productivos
en alelos diferentes al que codifica un autoanticuerpo, la edición pone en
riesgo el principio de exclusión. Sin embargo es raro encontrar células B portadoras
de receptores múltiples o que segreguen más un anticuerpo (31). Las re-ediciones
de exones VJ pueden generar células B multi-reactivas que suelen ser parcialmente
autoreactivas. Esto mantiene activa la recombinación en locus de cadenas livianas
y puede conducir a la eliminación de los exones autoreactivos o a la apoptosis. Por
otra parte no todos los rearreglos productivos terminan instalados como receptores:
a esto se le llama “exclusión fenotipica”. Se han descrito células B auto-tolerantes
que expresan dos exones Kappa pero que a nivel de membrana solo muestran la
cadena capa correspondiente al exon editado. Sin embargo en zona marginal se han
descrito células B parcialmente auto-reactivas, que expresan receptores duales λ y
κ (31) y esto sería una violación al principio de exclusión clonal. De hecho se han
descrito linfocitos B con receptores de diferente reactividad (29).
También los eventos secundarios de recombinación T pueden producirse en
el otro alelo y esto puede conducir a una frecuencia relativamente alta de células
T que llegan a expresar dos tipos diferentes de cadenas alfa en sus receptores. En
realidad la frecuencia de rearreglos en el otro alelo alfa llega a 1/3 de las células T,
pero la cantidad de receptores con diferente reactividad es mucho más baja debido
a mecanismos postranscripcionales de exclusión alélica (30).
La biología de los rearreglos secundarios en células B y T es muy parecida.
Cuando los receptores B o T son eficientes y no autoreactivos emitirían una señal
constitutiva de baja intensidad, que provocaría represión de genes RAG: de
esta manera detendría la progresión de la actividad recombinatoria en los locus de
cadenas livianas o de sus equivalentes T alfa o delta. Esta señal debería ser contínua,
dado que su interrupción mediante anticuerpos anti-MHC resulta en una
reactivación de los genes RAG (10). Recordar que los receptores T son probados
contra Ag ubicados en el surco presentador de Moléculas del Complejo Mayor de
Histocompatibilidad (MHC). Cuando la reactividad entre el receptor y su Ag es
muy fuerte se produce un complejo que es internalizado para su degradación posterior.
Con la desaparición del receptor queda interrumpida la señal constitutiva
inhibitoria que bloquea la expresión de los genes RAG. Tampoco emiten señal
inhibitoria las células con baja concentración o disfunción de receptores. De una u
otra forma la supresión o agenesia de dicha señal implica la progresión de la actividad
recombinatoria a nivel de los locus de cadenas livianas o sus equivalentes en células T
(10). Si finalmente no es posible el desarrollo de receptores antigénicos eficientes, no
autoreactivos y en cantidad suficiente, la célula es eliminada (Selección Negativa).
Hipermutación Somática
Una vez re-arreglados los genes de línea germinal y diseñado el exon codificante puede
comenzar la transcripción, que culminara en la construcción de un Receptor Antigénico
definitivo. Mientras el linfocito B permanezca en estado virginal dicho receptor no
sufrirá modificaciones adicionales. Una vez puesto en contacto con un Antígeno afín,
en los Centros Germinales de Ganglio o Bazo, las Células T CD4+ (Helpers) promoverán
un intenso proceso de substituciones de pares de nucleótidos a nivel de los exones
codificantes de región variable para cadenas livianas y pesadas (32-35).
A este fenómeno se le llama Hipermutación Somática (HS) y resulta de mutaciones
puntuales que solo pueden ocurrir en exones ya re-arreglados, una vez desactivados
los genes RAG y silenciada la etapa recombinatoria de segmentos genéticos.
La intensidad de las mutaciones es aquí un millón de veces más intensa que la que
podría desencadenarse en línea germinal de manera espontánea. Mediante este recurso
los linfocitos “maduran la afinidad” de sus receptores (36). Por eso los linfocitos B
que se aislan en función de su reactividad ante un mismo determinante antigénico
suelen presentar un amplio espectro de afinidades. El Sistema Inmune selecciona,
para su diferenciación a Células Plasmaticas o B Memoria, aquellos linfocitos B que
despliegan mayor afinidad frente a limitadas cantidades de Ag expuesto en la superficie
de las Células Dendríticas en los Centros Germinales (CG) (32-35).
La etapa de HS coincide con un significativo incremento en la producción de
Citidin Deaminasa Inducida por Activación de Linfocitos B (AID). Esta enzima
induce mutaciones en genes re-arreglados de Región Variable, exclusivamente en
linfocitos B, mediante conversión de Deoxicitidina en Deoxiuridina (32-35).
Recombinación para Cambio de Clase de Inmunoglobulinas
(CSR)
Casi simultáneamente con la HS comienza el Cambio de Clase de Igs, Class Switch
Recombination o CSR que es el recambio de regiones constantes en los genes
recombinados de Inmunoglobulinas. El CSR es un proceso que permite diversificar
la función efectora de las Igs mediante conversión de regiones constantes de
cadenas pesadas de Cμ a Cγ, Cα o Cε. Acorde con los requerimientos funcionales
las IgM/IgD cambian de Clase a IgG, IgA, IgE y subtipos (1-3, 35).
Los procesos de Hipermutación Somática y Cambio de Clase de Ig son exclusivos
de Célula B y solo pueden activarse cuando la tarea de recombinación genética
ha concluido. Estos fenómenos se producen a nivel de los Centros Germinales en
Ganglios o Bazo y son dependientes de la interacción entre células B y T (1-3,35).
El CSR es similar a la recombinación V(D)J en dos aspectos: implica roturas
de doble hebra y fusiones dependientes de un Sistema No Homólogo de Reparación
de Terminales Cortados (NHEJ) (38).
El locus de segmentos Constantes de Cadenas Pesadas (CH) está constituido
por una serie de genes CH, cada uno precedido (en 5’) por una región “cambio” o
“switch” (S). El CSR ocurre entre dos regiones S caracterizadas por tandems repetitivos
de secuencias palindrómicas. Dado que el gen Cμ es proximal al exón VH,
el CSR entre Sμ y alguna otra región S (ε,α,γ) provocará el reemplazo del Cμ por
el CH correspondiente. El CSR culmina en el reemplazo del exon Cμ por alguno
de los segmentos constantes pesados (CH) ubicados corriente abajo. Para esto se
requiere la deleción del ADN intermedio entre dichos segmentos y la producción
de ADN Circular como subproducto de escisión (1-3,37,38).
Cada región S contiene secuencias pentaméricas ricas en Guanidin Nucleótidos,
pero la exacta secuencia primaria varía mucho de una a otra. En la rata las
secuencias S abarcan repeticiones de 49 pb en Sγ, 40 pb en Sε, 80 pb Sα, etc, pero
algo similar ocurre en otras especies, incluyendo humanos. Cuando el ADN es
desnaturalizado, las secuencias palindrómicas de estas regiones switch (S) pueden
formar estructuras espontáneas tipo asas o círculos de ADN. La ausencia de este
tipo de secuencias anula el CSR por completo (37,38).
Desempeñan aquí un rol muy importante las IL-4 e IL-5. La estimulación
por estas citokinas induce la transcripción de ADN germinal desde un promotor
intrónico ubicado a 5’ de cada región Switch (S) y la síntesis de novo de CSR
recombinasa o quizás la síntesis de su activador (52). Por otra parte la activación
de la transcripción a nivel de las regiones S facilita per se a la recombinasa CSR su
acceso a las mismas (37,38).
La recombinasa CSR no sólo reconoce la secuencia primaria de las regiones S
sino que también reconoce su estructura secundaria. La transcripción de regiones S
con orientación opuesta a veces genera CSR de tipo invertido en lugar de tipo delecional.
Por otra parte la eficiencia de la recombinación se correlaciona de manera
positiva con la actividad transcripcional y esto sugiere la existencia de una asociación
entre las maquinarias al servicio de ambos procesos. La transcripción abre transitoriamente
las hebras de ADN e induce la formación de plegamientos de hebra simple
(sobre sí mismas) que generan estructuras símil asa (a la manera de un lazo).
Estas estructuras secundarias, con forma de “chupetín”, son reconocibles por
la CSR recombinasa y resultan de interacciones complementarias entre secuencias
palindrómicas de regiones Switch (S) de una hebra singular.
Deaminasa Inducible por Activación (AID)
La activación de CSR coincide con la expresión de una enzima llamada AID por
Citidin Deaminasa Inducible por Activación (de CSR). AID es una proteína
indispensable para la diversificación de los genes de Ig, para la maduración de la
afinidad (HS) y para la determinación del destino funcional de las Ig (CSR). AID
conforma un tetrámero que sólo puede desaminar citidinas en moléculas de ADN
y no es activa sobre ARN. Solamente puede unirse a hebras simples de ADN
y esto remarca la estrecha vinculación existente entre hipermutación somática y
transcripción (33,34).
La enzima AID se expresa específicamente en Células B cuando estas toman
contacto con su Ag en los Centros Germinales del tejido linfoide. Pero AID interviene
tanto en CSR como SH a pesar de tratarse de procesos totalmente diferentes.
En pacientes con Síndrome de Hiper-IgM tipo II se han identificado mutaciones
en el gen de esta enzima AID. Probablemente AID intervendría en un proceso de
corte de hebras de ADN que sería común tanto a CSR como a HS (33,34,39).
La expresión ectópica de AID induce HS y CSR en células no B como
Fibroblastos y Células T. Todo esto demuestra que AID es esencial y suficiente
para dos alteraciones genéticas diferentes inducibles por estimulación antigénica
de Células B de mamíferos.
La expresión de AID está restringida a los Centros Germinales. Los animales
transgénicos deficientes en AID no pueden producir IgG, IgA o IgE pero sí pueden
fabricar excesos de IgM aunque no hayan sido inmunizados. En el Síndrome
de Hiper-IgM ligado al CrX (tipo 1) el fenómeno es similar y se debe a defectos en
CSR por mutación en el gen del CD40L. Una variante (tipo 2) de este síndrome se
debe a mutaciones en el gen que codifica la enzima AID (Cr12p13). Los pacientes
con esta variante de Síndrome de Hiper-IgM carecen también de Hipermutación
Somática pero tienen recombinación V(D)J normal (37-40).
El desarrollo de Linfocitos B depende en gran medida de la indemnidad de los CG
Los animales con “Alinfoplasia” (Aly) se caracterizan por una mutación que afecta el dominio de interacción con Linfokina Beta de la Kinasa Inductora de NFkB (NIK) (43). En estos animales la Linfokina B no puede activar a la kinasa NIK y esta entonces no puede liberar NFkB. Queda de esta manera bloqueado el desarrollo de Nódulos Linfáticos y Placas de Peyer y en el Bazo se evidencian severas alteraciones estructurales (42,43). En los ratones transgénicos que presentan esta
mutación, tanto la HS como la CSR están severamente dañadas. Los animales deficientes en Linfotokina alfa y TNF alfa también presentan defectos en la estructura de sus Folículos Linofoides y alteraciones en HS y CSR (45,46).
Queda claro entonces que los CG son estructuras casi imprescindibles para un desarrollo normal de Células B. Pero hay excepciones a la regla. La IgG3 que se forma en la Zona Marginal de ganglios o bazo y gran parte de la IgA que se produce en intestino, responde a estimulación antigénica independiente de Linfocitos T. Por otra parte ha sido demostrado que las Células B pueden se sometidas a HS y CSR en la pared intestinal (lamina propria) (47). Mediante hiperinmunización es posible inducir HS y CSR en animales Aly/Aly, LTalfa -/- y Lyn -/- caracterizados por formación
defectuosa de CG. También es posible detectar un cierto grado de HS en linfocitos B de enfermos que padecen Síndrome de Hiper-IgM tipo I, provocado por mutaciones en el Ligante de CD40, caracterizado precisamente por carencia de CG (45-47).
En definitiva, el ámbito del CG favorece los fenómenos de HS y CSR pero no es exclusivo.
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*capitulo extraído del libro: El Sistema Inmune: Genética, Biología Molecular, Clínica, Farmacología / Autores: Ricardo Antonio Giuliani y Eleno Martínez Aquino - 1a. Ed. - Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.
Eritroferon S.R.L., 2011.
ISBN 978-987-27121-0-5
