cap. 10. Biología de la Célula B

Autor:
Ricardo Antonio Giuliani

En 1956 se demostró que las aves perdían su capacidad de producir anticuerpos si
se les ablacionaba la Bursa de Fabricius en las primeras horas de vida (1,2).
Años después se vio que la timectomía en ratas recién nacidas provocaba la pérdida
definitiva de sensibilidad retardada y promovía tolerancia al alloinjerto (3).
Similares ablaciones practicadas en animales maduros no ocasionaban alteraciones
ostensibles en producción de anticuerpos, tolerancia al injerto o hipersensibilidad
retardada.
Posteriormente quedó claro que la Bursa de Fabricius es un órgano linfoepitelial
inexistente en mamíferos y que estos fabrican sus linfocitos de linaje B en
Médula Osea. Pero la denominación “B” evoca Bursa de Fabricius y la “B” de Bone
Marrow es coincidencia idiomática (3,4).
A partir de entonces se entendió que tanto aves como mamíferos tienen Timo
y que todos los vertebrados producen linfocitos de linajes B y T (2,3).
Desde la aparición de Inmunidad Adaptativa en vertebrados con mandíbula, hace 500 millones de años, peces, aves, mamíferos y humanos disponemos de Células B y T (5).
El punto de partida para el descubrimiento de Células B fue la identificación
de proteínas con función de anticuerpo: gammaglobulinas (6).
Posteriormente se comprobó que las inmunoglobulinas eran fabricadas por
Plasmocitos y que estos en realidad constituyen la etapa final de diferenciación de
las Células de Estirpe B (7).
Un hito importante en biología de anticuerpos y células B fue observar que
cada Célula produce un receptor (BCR) de exclusiva especificidad sobre determinado
antígeno (8,9).
La genética de los receptores B (BCR) y T (TCR) fue descrita en un capítulo
específico. Su lectura es imprescindible para entender el origen de la diversidad
reactiva de estos receptores.
La autorenovación y diferenciación de los precursores de Células B depende de sus
interacciones con Células Estromales (CE) y matriz extracelular de Médula Osea (MO).
La IL-7 es una citokina segregada por células estromales de Médula Osea
(MO) y Timo, que estimula la diferenciación de Stem Cell a progenitores linfoides
y tiene efecto proliferativo sobre Linfocitos B, T y Células NK (10, 11).
Para ejercer su efecto proliferativo y diferenciador sobre células pre-pro-B la
IL-7 forma heterodímero con un factor hepatocitario de crecimiento (12).
Pero la progresión ulterior de progenitores linfoides a células B maduras IgM+
requiere factores estromales adicionales (13,14).
Las Células B se originan en células tronculares hematopoyéticas (HSCs) hepáticas
en el feto y MO en el adulto.
La ruta de diferenciación a célula B madura y plasmocito productor de anticuerpos,
atraviesa diversas etapas caracterizadas por funciones y fenotipos específicos.
Las células B abandonan la MO en estadio transicional B y completan su
maduración en periferia (15,16,17).
Las Células B y T construyen sus receptores sobre bases estructurales muy parecidas,
pero guardan entre sí importantes diferencias estructurales y funcionales.
Los receptores T (TCR) solo pueden reconocer antígenos (Ag) peptídicos o
lipídicos presentados en el surco de moléculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad
(MHC) o sus variantes CD1 (18,19).
Los receptores B (BCR) reaccionan sin intermediarios con el Ag y a diferencia
de los receptores T (TCR), pueden adquirir forma soluble. La reacción BCR/Ag es
mucho más fuerte que la interacción TCR/Ag, por eso no necesita Co-receptores
como sucede en el caso de las Células T (CD4 o CD8).
Las Células Plasmáticas producen una versión soluble de BCR conocida como Inmunoglobulina
(Ig) o Anticuerpo. La solubilidad de estas moléculas resulta de la ablación
de la región hidrofóbica (TM) que utiliza el BCR para su anclaje a membranas (20).
Tanto la Ig como su versión fija (BCR) reaccionan contra aristas, regiones o
conformaciones específicas (epitopes) de moléculas denunciadas como “antígenos”
por el sistema inmune innato.
Los TCR solo pueden reconocer pequeños fragmentos proteicos exhibidos en el surco
de moléculas del MHC (TCR-αβ) o lipídicos en moléculas CD1 (TCR-γδ) (19).
Cualquier estructura tiene la potencialidad de funcionar como antígeno incluso
moléculas sintéticas no existentes en la naturaleza.
Pero es el sistema inmune innato quien confiere carácter antigénico a una molécula.
Esto ocurre cuando interpreta que dicha molécula puede poner en riesgo la
integridad del individuo. Entonces reacciona generando anticuerpos y a veces ocasiona
fenómenos autoreactivos. (Ver Síndromes Autoinmunes de Superposición
y Anticuerpos Autoinmunes)
En realidad, el concepto “antigeno” describe la perplejidad y desconocimiento
de quienes acuñaron dicha palabra. En ese momento se pensaba que era la molécula
extraña la generaba la reacción inmune, de allí surgió el concepto “antigeno”.
Sin embargo, dicha categorización es administrada por el sistema inmune innato
e instrumentada por el sistema adaptativo. Para que esto ocurra, la molécula
debe ser registrada como peligrosa por receptores Toll Like (TLR) (21). (Ver Biología
de Célula T y Síndromes Autoinmunes de Superposición)
El Sistema Inmune Adaptativo (SIA) está preparado para responder contra todo
tipo de antígeno concebible y en esto están incluidas moléculas del propio individuo.
Por eso una de las grandes tareas del SIA consiste en el desarrollo de tolerancia
hacia moléculas propias y preservación de la capacidad para desarrollar fuertes respuestas
contra moléculas peligrosas.
El Receptor Antigénico de la Célula B (BCR) integra un complejo multiproteico
simétrico que resulta del ensamble de una Inmunoglobulina (Ig) ligada a la
membrana (mIg) con dos heterodímeros Igα/Igβ asociados de manera no covalente
a sus cadenas pesadas (22).
La mIg está compuesta de dos cadenas pesadas de Ig de alguno de los cinco
isotipos descritos y dos cadenas livianas de alguno de los dos tipos conocidos (23).
Las Igα (CD79a) e Igβ (CD79b) son proteínas transmembrana (TM) de estructura
parecida, que pertenecen a la superfamilia de inmunoglobulinas y están
codificadas por genes mb-1 y B29.
Igα (CD79a) e Igβ (CD79b) son auxiliares de señalización al servicio del
BCR y no tienen función de anticuerpo: NO deben confundirse con el BCR y las
Inmunoglobulinas (mIgs) (24).
CD79a y CD79b poseen un dominio extracelular, una región TM y una cola
citoplasmática portadora de un Motivo Inmunoreceptor de Ativación basado en
Tirosina (ITAM).
Ya discurrimos sobre dominios ITAM e ITIM en el capítulo Biologìa de Célula
T, pero recordemos que sus tirosinas fosforiladas sirven de anclaje a moléculas
involucradas en señales de Activación (ITAM) o de Inhibición (ITIM) (25,26).
Tanto los dominios proximales como las regiones TM de mIg desempeñan un
papel crítico en el armado del BCR, porque facilitan la asociación no covalente con Igα
e Igβ. Reiterando: “mIg” representa una de las dos cadenas que componen un BCR.
Las regiones TM de cadenas pesadas de mIg son muy hidrofóbicas, tienen
estructura α-hélice y abarcan 25 aminoácidos (AA). Una parte de la región TM
tiene una secuencia de AA común a todas las variantes de cadenas pesadas y
la otra es específica de clase y está involucrada en los eventos relacionados con
oligomerización del BCR (27).
Las proyecciones citoplasmáticas de las mIgM y mIgD tienen sólo 3 AA y
obviamente carecen de sitios para anclaje de moléculas de señales. La ocupación
del BCR por su antígeno específico produce cambios conformacionales que se propagan
a los heterodímeros Igα/Igβ y habilitan la fosforilación de sus ITAMs.
Las fosfotirosinas de los ITAMs fijan a la membrana moléculas que se movilizan desde
el citosol y promueven complejos ensambles de señalización, llamados signalosomas (28).
La composición de los Signalosomas varia con el tipo de Ag involucrado, la
interacción con células T helper (CD4+) u otras células aledañas y el estadio madurativo
del linfocito B (29).
Acorde con la naturaleza de dichos complejos o signalosomas pueden activarse
señales de proliferación, diferenciación o apoptosis.
Cuando se separan del Ribosoma las inmunoglobulinas mIgM, mIgA y mIgE
quedan retenidas en el Retículo Endoplásmico (RE) por interacciones entre residuos
de su región TM y el RE. Una vez complejadas con heterodímeros Igα/Igβ se desprenden
del RE y son translocadas a la membrana. Las IgG y en algunos casos también
las IgD no requieren de Igα/Igβ para su movilización hacia la membrana (30).
La reacción entre el antígeno (Ag) y el receptor B (BCR) puede provocar
proliferación y diferenciación o inhibición de crecimiento.
Cuando el BCR es IgM (mIgM), la interacción con el Ag provoca rápida
fosforilación de 10 o más proteínas diferentes.
La tirosin kinasa Lyn es una enzima de familia Src que se expresa preferentemente
en células B y coprecipita con IgM e IgD, por consiguiente se encuentra
físicamente asociada a Inmunoglobulinas de membrana (mIgs).
La reacción Ag-IgM/D provoca rápida fosforilación y activación de Lyn, a la
vez que asociación de Lyn con la subunidad 85 kDa de PI3K (31,32).
Una vez activada Lyn forforila ITAMs en la cola citoplasmática de Ig alfa e Ig
beta y dichos ITAMs reclutan Syk, Fosfolipasa Cγ2 (PLCγ2) y Fosfatidil-Inositol-
3-Kinasa (PI3K). Dichas enzimas desempeñan roles críticos en proliferación,
movilización de Ca++ intracelular y diferenciación celular (33).
Pero además Lyn activa señales inhibitorias, mediante fosforilación de ITIMs
en proyecciones citoplasmáticas de CD22, PIR-B y FcγRIIb1. La fosforilación de
estos ITIMs habilita el anclaje y fosforilación de las fosfatasas inhibitorias SHIP-1
y SHP-1 (34,35,36).
En suma, la activación de Lyn provoca fosforilización de ITAMs en moléculas
asociadas al BCR e ITIMs en receptores Fc y CD22. Este sofisticado juego de
activación (BCR) e inhibición (FcR y CD22) conducido por Lyn permite regular
el umbral de activación de la célula B (37,38).
Los ratones transgénicos afectados por una mutación Lyn con ganancia de
función producen células B con decremento en moléculas co-estimuladoras e
mIgM. Esto da lugar a sobre expresión de señales positivas vía Syk y PLCγ2, con
generación de anticuerpos autoreactivos y desarrollo de glomerulonefritis letal.
En definitiva, la preservación del balance entre excitación e inhibición es importante
para el sostenimiento de la “tolerancia” hacia moléculas propias (39,40).
Por eso la industria farmacéutica eligió la Kinasa Syk como potencial blanco
terapéutico para enfermedades autoinmunes. El bloqueo de Syk interrumpe las
señales positivas sin afectar las señales negativas de Célula B.
La pro-droga R788 es un inhibidor de Syk y fue probada en diversos modelos in
vivo e in Vitro, para evaluar su potencial aplicación a pacientes con Artritis Reumatoidea
(AR). A la dosis de 100 y 150 mg R788 produjo beneficio significativo en pacientes
con AR. Este recurso terpéutico todavía no está en el mercado para uso masivo (41).
La sigla Syk representa Spleen tyrosine kinase. Syk y Zap 70 son miembros
de una misma familia de Kinasas. Son enzimas no-receptoras y ambas exhiben el
característico tandem en dominios SH2 (ver Biología de la Célula T). Syk desempeña
tareas de señalización en BCR, FcR e integrinas.
La activación constitutiva de Syk puede inducir transformación maligna en
células B. Diversos virus contienen ITAMs en su estructura y estos pueden activar
Kinasas Syk, un ejemplo es el caso del Virus Epstein Barr (42,43,44).
Las señales emitidas desde el receptor antigénico B (BCR) o su precursor
pre-BCR, regulan el desarrollo y función de las células de progenie B en cada etapa
madurativa. Dichas señales cambian dramáticamente en cada estadio y resultan en
activación cuando la célula es madura o en edición, anergia o apoptosis cuando la
célula es autoreactiva (45).
Cuando el complejo BCR de una célula B madura toma contacto con su Ag, lo
primero que ocurre es su rápida movilización hacia compartimientos de membrana
ricos en colesterol y esfingolípidos, resistentes a detergentes, llamados Rafts Lipídicos
(5,6). (Ver Rafts Lipídicos en Biología de Célula T) (46,47).
Los Rafts son concentradores de tirosinkinasas scr de familia Lyn y sus reguladores,
verdaderas plataformas de apoyo para ensambles de señalización BCR.
La fosfatasa CD45 opera fuera de estas estructuras (47).
Luego de ligado a su Ag el BCR es internalizado y degradado en lisosomas.
Los BCR de Células B inmaduras señalizan desde afuera de los mencionados Rafts
y no son translocados a Rafts cuando toman contacto con el Ag.
La localización intra/extra rafts resulta en diferencias conformacionales entre
los signalosomas de células B maduras e inmaduras y explica, en parte, el peculiar
comportamiento del BCR en ambos estadios de desarrollo (48).
Factores Transcripcionales y Diferenciación en Células B
Los estadios tempranos en el desarrollo de Células B están regulados por al menos
10 Factores Transcripcionales (FT), pero los que comprometen a linaje B son E2A,
EBF y Pax5 (49).
Pax5 es en células B un verdadero “guardian” de identidad funcional y exhibe
afinidad por secuencias promotoras en el locus de Inmunoglobulinas. En
ratones transgénicos la deleción de Pax5 bloquea los rearreglos DJ a VDJ y
detiene la progresión madurativa de progenies B. Este FT regula la expresión e
al menos 170 genes, muchos de ellos involucrados en señalizaciones, adhesión
y migración de células B (50).
Dentro de determinadas condiciones experimentales, la deleción Pax5 promueve
la des-diferenciación hacia progenitores no-comprometidos a linaje B y
ulterior conversión en células de linaje T. Otro dato interesante es que los animales
que padecen deleción o mutación Pax5 pueden desarrollar linfomas y que el 30%
de las Leucemias Agudas de estirpe B en niños presenta mutación Pax5 (51,52).
Familia FOX de Factores Transcripcionales
La familia de factores transcripcionales (TF) Forkhead Box (Fox), compuesta
de Fox01, FoxO3a y FoxO4 fueron identificadas en especies tan dispares como
levaduras y humanos.
La familia Fox de TF interviene en un amplio rango de procesos fisiológicos,
incluyendo inhibición de proliferación celular y promoción de apoptosis. Una de
sus tareas consiste en mantener quieto el ciclo celular.
A nivel experimental la activación constitutiva de Fox detiene el ciclo celular e
induce apoptosis en diverso tipo de células (53).
De hecho, en sarcomas (54) y leucemias, suele ocurrir el fenómeno inverso, con sobre
activación del ciclo celular por deleciones o mutaciones disfuncionantes en genes Fox (55).
En definitiva, la eliminación de Fox del núcleo constituye un factor crítico para
la progresión del ciclo y habilitación de señales de sobrevida celular (56).
La expresión y función de Fox TFs es particularmente importante en el caso del
sistema inmune. La cantidad de células B y T que entra finalmente a la periferia es sólo
una fracción del total generado inicialmente. Las células que ingresan a la sangre deben
ser mantenidas en estado de quiescencia hasta encontrar su antígeno. En ese momento
proliferan y se diferencian en células efectoras (Plasmocitos) o B memoria.
La reacción BCR/Ag habilita señales de sobrevida y propaga fosforilaciones en
cadena, de PI3K a Proteína Kinasa B (Akt) y de esta a Fox, culminando en degradación,
exclusión nuclear y liberación del freno quiescente de este TF (57,58,59).
Como contrapartida, la sobre expresión constitutiva de Fox activado detiene el
ciclo celular e induce apoptosis. Por eso la modulación de la actividad de miembros de
familia Fox constituye un paso crítico en la activación de células B por su Ag (56-61).
Pero PI3K activa también una ruta de señales mediada por tirosin kinasa Bruton
(Btk), miembro de familia Tec, que señaliza a través del adaptador BLNK (B
cell Linker) y la fosfolipasa C gamma 2 (PLCγ2), provocando movilización de
calcio intracelular (60,62,63).

Tirosin Kinasa Bruton (Btk)
La activación de Células B habilita cascadas de fosforilaciones que involucran Kinasas
no receptoras de familia Tec, una de ellas es la Tirosin Kinasa Bruton (Btk)
descubierta en 1993.
Las kinasas de familia Tec son activadas por diverso tipo de signalosomas ensamblados
en la cara citosólica de la membrana plasmática.
Los receptores de membrana utilizan función kinasa incorporada (RTKs) o
kinasas asociadas, como sucede con JAK (Citokinas), FAK (integrinas) o Src/Syk/
Zap70 (receptores B y T).
La excitación de receptores Pre-B y BCR provoca fosforilación de ITAMs
en Igα e Igβ, atracción y fosforilación de Syk y exposición de dominios Plextrina
Símiles (PH). Los dominios PH reclutan Btk a la membrana y esta es activada por
signalosomas activadores. (Ver Señalizaciones)
Btk constituye un eslabón crítico en la secuencia de fosforilaciones desencadenada
por excitación de receptores Pre-B y BCR.
Pre-BCR libera vía Btk y fosfoproteína adaptadora SLP-65, señales críticas para la inducción
de rearreglos en cadenas livianas de mIgs y la progresión madurativa de células B.
La ruta Btk/SLP-65 provoca sobre-expresión de reguladores del ciclo celular
y genes antiapoptoicos.
Por otra parte Cbl-b promueve de manera sostenida el incremento del Ca++ en el
citosol, contribuyendo en la formación del complejo Btk/BLNK/PCL-γ2 (64,65).
Además, la reacción BCR-Ag modera la producción de mRNA-Fox01 vía
PI3K/Btk/BLNK/ PLCγ2.
La kinasa Btk exhibe un dominio PH ligante de PIP3. La activación del receptor
B provoca la activación de PI3K y esta habilita la fosforilación del Fosfatifil
Insitol en la posición 3 de su anillo, generando PIP3. La aparición de PIP3 provoca
el anclaje a membrana de la kinasa Btk y esta es entonces inducida a fosforilar
Fosfolipasa C. Esta última hidroliza PIP2 generando dos mensajeros secundarios:
Inositol 3 Trifosfato (PI3) y Diacilglicerol (DAG).
DAG, que permanence ligado a la membrana, atrae a la membrana y activa la
Proteína Kinasa C (PKC).
La PKC fosforila grupos Hidroxilo en Serinas y Treoninas y participa en la
activación de diversas cascadas de señalización. PI3 abre canales de Calcio e incrementa
su concentración en el citosol (66).
El gen de Btk que se localiza en el cormosoma X, está implicado en una inmunodeficiencia
caracterizada por Agammaglobulinemia (de Bruton o ligada al Cr X).
En estos pacientes se registra concentración normal de células Pre-B en MO
pero falta de progresión en su maduración y acceso a la circulación sistémica.
La función o expresión del gen BTK puede estar afectada por al menos cuatrocientas
mutaciones diferentes. Esto provoca severa reducción en la producción de cadenas
livianas Kappa y Lambda y bloquea la maduración de Células B (67,68,69,70).
Btk, Fox y Agamablobulinemia ligada al Cr X (Bruton)
La reacción Pre-B/BCR-Ag modera la producción de mRNA-Fox01 vía PI3K/
Btk/BLNK/ PLCγ2. La activación de la kinasa Btk resulta entonces imprescindible
para la progresión del ciclo celular y expresión de genes antiapoptoicos. Por eso
la agenesia de Btk provoca Agamaglobulinemia (de Bruton) (68,69,71).
Además, la deleción o mutación con pérdida de función Fox constituye un
hallazgo frecuente en diverso tipo de sarcomas (72) y leucemias (73).

Apoptosis y Sistema Inmune Adaptativo
Mediante muerte celular programada o apoptosis se eliminan linfocitos B y T
disfuncionantes o autoreactivos y se cierra la respuesta inmune una vez neutralizado
el agente infectante. De hecho algunos casos de inmunodeficiencia,
linfoma o autoreactividad se explican por defectos en mecanismos de apoptosis.
Ver Apoptosis en Señalizaciones y los fenómenos autoinmunes relacionados con
mutaciones Bcl-2 y Fas descritos más abajo.

Regulación del desarrollo de las Células B
Las Inmunoglobulinas de superficie en Linfocitos B intervienen en respuestas inmunes
adaptativas y a la vez regulan una serie de puestos de control durante el desarrollo de la
Célula B. Estas respuestas fisiológicas son instrumentadas por complejos armados entre
inmunoglobulinas de membrana y heterodímeros Igα/Igβ traductores de señales.
Veremos que las inmunoglobulinas controlan la maduración de células B, desde
estadios tempranos Pre-Pro B independientes de Ag hasta estadios finales dependientes de Ag.

Etapas críticas
Tanto hemato como linfopoyesis tienen su origen en Células Tronculares (CD34+)
de la Médula Osea. En estas Células los locus genéticos de cadenas pesadas y livianas
permanecen en configuración germinal (74).
Desde su origen en Stem Cells de Médula Osea (HSC) los precursores de
Células B atraviesan diversas etapas madurativas, definidas por marcadores fenotípicos
y rearreglo y expresión de genes de inmunoglobulinas (75,76).

Precursores Linfoides Comunes (PLC)
(Cadena αIL-7R, c-Kit, CD34)
Entre las Células CD34+ se distinguen Progenitores Linfoides Comunes (CLP)
comprometidos a diferenciación linfoide B, T y Natural Killers.
Los PLC expresan cadena alfa de receptor de IL-7 y receptor c-Kit de SCF,
carecen de marcadores de superficie propios de estadio Pre-Pro B y mantienen
silentes los locus de Cadenas Pesadas y Livianas (77).
Los modelos recientes de linfopoyesis sugieren que CLP constituyen progenitores
específicos de linaje B (78,79).
Para su progresión madurativa los PLC dependen de interacciones directas
(c-Kit/SCF) e indirectas (IL-7R/IL-7) con células del estroma. Las Células Estromales
de Médula Osea desempeñan tareas vitales para el desarrollo y sobrevida
de las células hemato y linfopoyéticas.
Estroma deriva del griego “colchon” y así son designadas las células que tejen
el lecho que cobija células hemato y linfopeyèticas. Las células estromales segregan
IL-7 y expresan SCF en sus membranas. La IL-7 liga IL-7R sobre CPL y activa
señales de división y diferenciacón. Esta linfokina (IL-7) interviene en diversas
etapas evolutivas de los linfocitos B y T. Por otra parte el c-Kit (CD117) de los
CPL reconoce al Stem Cell Factor en la superficie de Células Estromales y de su
interacción resultan señales de sobrevida y desarrollo.
En CLP comienza el rearreglo de mIg de cadenas pesadas (H) y este proceso
continúa hasta alcanzar la etapa madurativa Pro-B (80,81).

Células Pre-ProB o Pro B tempranas
(RAG1/RAG2, TdT y rearreglo DJ)
La activación de los genes RAG1/RAG2 y TdT constituye la primera evidencia
de compromiso con linaje linfoide. A raíz de esto comienza a registrarse actividad
recombinatoria simultánea en locus de cadenas pesadas de Cr14 materno y paterno.
Los primeros rearreglos se producen entre segmentos D y J. Dado que los
segmentos D admiten tres marcos de lectura diferentes, todos los rearreglos DJ
resultan productivos (82).
El marcador más claro de compromiso con linaje B es el rearreglo DJ en Cr 14.
El rearreglo exitoso de un exon de fusion DJ en uno de los locus activa señales que
silencian la recombinación en el otro Cr14.
Dos marcadores de superficie permiten identificar a las células B progenitoras:
las moléculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC) tipo
II y la forma de alto peso molecular del CD45. El CD45 es una fosfatasa que
habilita la activación de receptores antigénicos B y T. Por Splicing Alternativo
pueden resultar dos versiones: una de alto peso y fuerte glucosilación y otra de
bajo peso y débil glucosilación. En su forma de baja glucosilación el homodímero
tiende a unirse fuertemente y ocultar sus sitios fosfatasa. En su forma de
alta glucosilación los monómeros CD45 se repelen y exponen sus sitios enzimáticos.
En linfocitos B predomina la forma de alto peso y fuerte glucosilación,
es decir la variante activa de CD45. Esta versión puede identificarse con Ab
monoclonales y se conoce como B220 (CD45/B220+). Pero debe señalarse que
B220 no es exclusiva de células Pre-Pro B (83).
Estas Células carecen del cofactor CD19 de BCR que está presente en
todos los estadios posteriores del linaje B. Completa la caracterización de las
Células Pre-Pro B la expresión del gen lambda 5 y otros que codifican factores
transcripcionales necesarios para la progresión madurativa del linaje B como
BASAP, E12 y E47.
Las Células Pre-Pro B pueden ser identificadas mediante un panel de marcadores:
CD45/B220+, CD11b/Mac1, CR1 (marcador de linaje mieloide granulocitico
macrofago), Ter 119 (marcador de linaje eritroide), CD24+ y la molécula AA
4.1 que se encuentra en Stem Cell y precursores de linaje B (84).
En etapa PrePro B se inicia la expresión de los genes de Igα e Igβ.
La recombinación somática puede resultar en sìntesis “productiva” o “no productiva”
de cadenas pesadas o livianas de Ig. Uno de los tres marcos de lectura del
ADN podría incluir un Codon Stop prematuro que genere un producto abortivo.
El fracaso en la generación de rearreglos funcionales y expresión de mIgs en tiempos
apropiados, conduce inexorablemente a la muerte celular (85,86).
Sólo un 50% de las Células B logra codificar cadenas pesadas (H) apropiadas.
Una vez expresada una cadena H la Célula puede probar rearreglos productivos
en los cuatro locus de cadenas livianas (L) e incluso cambiar aquellas que resulten
autoreactivas (Rescate de Cadenas Livianas). Sumando los potenciales fracasos en
recombinaciones de cadenas H y L, sólo un 24% de las Células comprometidas a
linaje B alcanza rearreglos aptos para el ensamble de un receptor B (BCR). Ergo, el
76% de los rearreglos que se producen en Células B resulta en exones frustros. Sólo
un 2% a 3% de las Células ProB alcanza el estadio de Célula B Madura (87,88).

Células ProB o ProB tardías
(Rearreglo V-DJ, Complejo Igα/Igβ-Calnexina)
En esta etapa de desarrollo de la Célula B la recombinación de cadenas H continúa
con rearreglos entre segmentos V y DJ. Los locus de Cadenas Livianas siguen en
configuración germinal.
Las Células ProB expresan un Pro-BCR caracterizado por el ensamble entre
heterodímero Igα/Igβ y Calnexina. La activación mediante anti-Igβ induce en
estas células expresión de marcadores típicos de células Pre-B.
El heterodímero Igα/Igβ recluta desde el citosol kinasas de familias src y syk,
las fija en fosfotirosinas de sus ITAMs y ensambla signalosomas para activación de
diversas rutas de señales (88,89).
La accesibilidad a los segmentos V, momento crítico para el arreglo V-DJ,
está regulada por Pax-5 e IL-7. Una vez superada esta etapa de recombinación, las
Células B necesitan Igβ para madurar y proliferar (90).
En estadio ProB tardío se expresa el Co-factor (de BCR) CD19 y el receptor
CD40 que pertenece a la superfamilia del Factor de Necrosis Tumoral. Desde aquí
en adelante comienza a detectarse actividad de Tirosin Kinasa Bruton (Btk).

Células PreB (Grandes)
(Pre-BCR= IgM/VpreB-λ5 y Proliferación Clonal)
Las células en estadio PreB han completado la recombinación en locus de cadenas
pesadas y los locus de cadenas livianas permanecen en configuración germinal.
No hay expresión de RAG1/RAG2 ni TdT en esta etapa.
La instalación de Pre-BCR en la membrana interrumpe la actividad de
los genes RAG/TdT. El Pre-BCR está compuesto por cadenas pesadas (H)
μ, λ5/VPreB, Igα e Igβ.
Las Células PreB proliferan para desarrollar un clon portador del gen de fusión
de cadena pesada que acaba de recombinar. Este gen de cadena pesada será el
modelo básico de reconocimiento antigénico para todo el clon. Dicho modelo será
posteriormente corregido y diversificado mediante el aporte de cadenas livianas,
hipermutación somática, edición, etc.
La expresión de mIgμ culmina en el ensamble del Pre-BCR y marca la transición
entre los estadios Pro y Pre B. Entre las funciones primarias del Pre-BCR se
cuentan la estimulación de la diferenciación B, la expansión clonal y la exclusión
alélica de cadenas pesadas (91).
La cadena λ5 es un substituto de cadenas livianas muy parecido a la región
constante de cadenas λ pero está codificado por un gen diferente. La cadena VpreB
es similar a los segmentos V de cadenas pesadas (H) pero carece del polimorfismo
característico de la región VH. λ5 se fusiona con VpreB y forma un surrogante de
cadenas livianas. Todo permite suponer que VpreB se une a un ligante que señaliza
mediante heterodímeros Igα/Igβ e induce a la célula a dividirse e iniciar la recombinación
en cadenas livianas (L).
El desarrollo de células Pre-B in vivo requiere la coparticipación de la cadena
μ y el heterodímero Igα/Igβ. De hecho los animales knock out para genes μ o Igβ
padecen de un bloqueo profundo en el desarrollo de células B. Los animales λ -/-
sin embargo sólo tienen bloqueo parcial en el desarrollo B (92).
En general los rearreglos de cadenas pesadas preceden a los de cadenas livianas,
pero un 15% de las células PreB normales completan el rearreglo de cadenas
livianas antes de que termine la recombinación de cadenas pesadas (93).
En definitiva, para proseguir con su desarrollo madurativo las Células
PreB necesitan surrogantes λ5/V-PreB o cadenas light convencionales. Tampoco
hay progresión madurativa ni exclusión alélica en estadio PreB, si no
son fosforilados los residuos tirosina en los ITAMs de las proyecciones citoplasmáticas
de Igα/Igβ (94).
Las Src Kinasas (Lyn, Fyn, Blk) contribuyen de manera sustancial a la progresión
madurativa B, pero dado que sus funciones son redundantes, el silenciamiento individual
de alguna de ellas no entorpece dichos procesos de manera contundente (95,96).
Los linfocitos que fracasan en el intento de ensamblar un Pre-BCR no pueden
progresar en su desarrollo y son delecionados.

Células PreB Tardías (Pequeñas)
(Rearreglo VJ de Cadenas Livianas)
En esta etapa las Células B completan la recombinación VJ en cadenas Livianas. Para
esto deben reactivar la expresión de genes RAG1/RAG2 y TdT e interrumpir la expresión
de cadenas livianas surrogantes. Observese que la Célula B activa y desactiva
estos genes acorde con sus requerimientos evolutivos y ambientales (autoantígenos).

Células B inmaduras
(BCR IgMhigh/IgDlow)
Llamamos Células B inmaduras a las primeras Células de linaje B que expresan
BCR. En estas células predomina la IgM y es muy escasa la presencia de IgD. Los
Linfocitos B Inmaduros permanecen un promedio de 3.5 días en el compartimiento
inmaduro. En esta etapa las células autoreactivas que fracasan en la edición de sus
BCR son eliminadas o energizadas (97).
Las células inmaduras se diferencian de las maduras por su gran susceptibilidad
a la apoptosis y esto apoya la hipótesis de que la tolerancia es ejercida durante el
desarrollo de la célula B. La tolerancia es un proceso activo que depende de señalizaciones
provenientes del BCR.
De hecho los animales infundidos desde el nacimiento con anticuerpos (de
carnero) anti-IgM de raton, desarrollan pocos centros germinales en bazo y ganglio,
generan poca cantidad de plasmocitos, exhiben escasa síntesis de IgM e IgG,
virtual ausencia de IgA en intestino y marcada depleción en células B productoras
de IgG, IgM e IgA en bazo y en suero (98).
Estos exprerimentos reproducen con anti-IgM el efecto supresor.
Estos experimentos dan cuenta del efecto supresor que ejerce la ocupación del
receptor B en células inmaduras. En este caso el BCR.
Reacciona fuertemente contra un anticuerpo anti-IgM y en el caso de la tolerancia
contra un Ag propio.
En síntesis: la vitalidad de la célula B depende de la integridad funcional de su
receptor (BCR). La tolerancia toma ventaja de la exquisita sensibilidad del BCR
inmaduro frente a estímulos ambientales (autoantígenos) (99).

Células B Transicionales
(Mab493+)
Las Células B que emigran del compartimiento inmaduro de la Médula Osea y
alcanzan la Sangre Periférica son llamadas Células B Transicionales. Estas pueden
diferenciarse de las células B maduras por presentar en la superficie una serie
de marcadores característicos y reaccionar contra un Ab monoclonal tipico (Mab
493+) de células inmaduras (100).
Sólo un 10% a 30% de ellas puede acceder al Bazo y así lograr extender su vida
media de 5 días a 15 o 20 semanas.
El tamaño del compartimiento transicional es variable mientras que el de los
linfocitos B maduros es bastante estable (101).
La inmunización o la infección pueden decrementar la cantidad de células
transicionales de manera aguda, dando lugar a un efecto rebote posterior (102).
Es posible que la homeostasis del pool periférico de células B sea mantenida
mediante modificaciones en los umbrales de selección positiva y negativa. De cualquier
manera es evidente que la progresión de la diferenciación a células maduras
depende siempre de la integridad del BCR: su ablación experimental induce apoptosis
de Células B en cualquier etapa de su desarrollo (103).
Los BCR de Células Transicionales y Maduras responden igual contra la exposición
a LPS, pero con anti-CD40 las Células Maduras responden mejor. La
ocupación del BCR (IgM) induce proliferación en Células Maduras y apoptosis
en Células Transicionales. De hecho este parece ser el mecanismo que conduce a la
selección negativa de las Células Autoreactivas (Transicionales) mientras permanecen
fuera del Bazo (100).

Células B Maduras (Naif)
(IgM+/IgD+)
Las Células B Maduras se caracterizan por expresar BCR con isotipo D y M en
similar proporción. Se trata de Células Vírgenes de contacto antigénico (Naif)
y pueden vivir hasta 15 o 20 semanas una vez que tomen contacto con Folículos
Linfoides. Si en ese tiempo no encuentran a su antígeno mueren. La interacción
Ag/BCR pone en marcha una serie de eventos que conducen al desarrollo de Plasmocitos
productores de Ig (de corta vida) y Células B Memoria (de larga vida). Es
interesante remarcar que existe un cierto grado de competencia entre linfocitos B
de reciente o vieja generación. Cuando se inyectan células B transgénicas, portadoras
de receptores identificables mediante citometria de flujo, se observa que su
proliferación depende del espacio que le dejen los linfocitos viejos. Si son inyectados
en animales linfopénicos, deplecionados mediante irradiación, se registra buen
nivel proliferativo y extensa vida media. Ocurre lo contrario cuando son inyectados
en animales normales. Esto indicaría que las células B compiten por las señales de
sobrevida emitidas desde los folículos linfoides.

Resumiendo
El desarrollo de Células B en MO atraviesa etapas muy ordenadas de rearreglo
secuencial en genes de cadenas pesadas (H) y livianas (L).
Las recombinasas RAG1 y RAG2 por primera vez estadio Pro-B para rearreglo
genético y síntesis de cadenas H funcionales. Una vez logrado el objetivo los
genes RAG son silenciados.
Luego la actividad RAG es reactivada en estadio Pre-B de pequeñas células,
para producción de cadenas livianas (L) Kappa y Lambda. Las células B completan
el ensamble de cadenas H y L con Igs alfa y beta, con esto queda definitivamente
conformado el receptor B (BCR) y las recombinasas vuelven a silenciarse.
Ahora la Célula B Inmadura debe someterse a selección negativa mediada
por Ag. Dicho proceso incluye deleción central por apoptosis, anergia o rearreglo
secundario (edición) del receptor, para eliminación de clones autoreactivos. Pero el
mecanismo predominante en selección negativa es edición del receptor (104).
Edición, Apoptosis o Anergia de Células B Inmaduras
Entonces, las Células B Inmaduras que surgieron con BCR(s) autoreactivos tienen
tres destinos posibles: Anergia, Apoptosis o Edición.
Se entiende por Edición de Receptores a la reactivación de la Recombinación
V(D)J para recambio de regiones variables en cadenas livianas. Los receptores
autoreactivos pueden ser reemplazados por BCR inocuos para Ag(s) propios.
La Anergia resulta del contacto entre BCR(s) autoreactivos y Ag(s) propios.
Esto genera Células B caracterizadas por alta concentración de IgD y
poca IgM. Las células anérgicas tienen dificultad para pasar del compartimiento
inmaduro al compartimiento de larga vida representado por el tejido esplénico.
Ergo, son de corta vida y decrementada expresión de BCR, quizás por
retención a nivel del retículo endoplásmico.
Dentro de las dos horas del encuentro antigénico, los BCRs de Células Autoreactivas
liberan señales inductoras de re-expresión de genes RAG1 y RAG2 para
habilitar un nuevo rearreglo de cadenas L.
Ahora la cadena L “refaccionada” es re-ensamblada con cadena H para construir
una versión no autoreactiva de BCR (105,106).
Solo pueden acceder a la sangre periférica aquellas células B inmaduras que
hayan aprobado los test medulares de selección negativa.
Las Células que producen sólo IgM son destruidas (delecionadas) cuando reaccionan
contra antigenos propios multivalentes, expresados en células de la Médula
Osea. A esto llamamos deleción clonal de células B autorreactivas (107).
Normalmente, la progresión madurativa de los linfocitos B auto-reactivos es detenida a nivel de la transición pre-B a células inmaduras e inmediatamente eliminadas (108-110).
La interacción entre el BCR y autoantígenos libera señales de reactivación y
sobreregulación de genes Rag, habilitando mecanismos de “edición” o corrección
de genes de cadenas livianas (111-113).
Este proceso de edición permite reemplazar la cadena L original y corregir la
desviación autoreactiva del BCR.
Una vez cumplida esta etapa, dichas células emigran de MO como Células B
Transicionales 1 (T1) y comienzan a atravesar diversos estadios transicionales.
Finalmente se diferencian en Foliculares B2, Células B de Zona Marginal y
Células B1 (114,115).
La sobrevida y maduración de células B – requiere de estímulos tónicos adicionales
a aqullos que emanan del BCR; dichas señales son emitidas desde CD19
y CD22 activados (116).
De hecho todo cambio de expresión o función en estas moléculas puede afectar
la maduración de Células B (117).
Para la diferenciación a MZ o B1 las Células B T1 requieren señales que dependen
directamente de la reacción BCR-Ag (118).
Pero en esto también es importante la intensidad de la reacción BCR-Ag,
porque una señal demasiado fuerte puede provocar anergia o deleción (119).
La edición de BCR puede ocurrir asimismo a nivel periférico, en células B
maduras y centro-germinales, pero en este caso la “revisión de receptor B” no está
destinada al silenciamiento de clones autoreactivos, sino más bien a la generación
de anticuerpos de alta afinidad (120).

Exclusión Alélica en Células B
Acorde con los modelos actuales sobre desarrollo de linfocitos B y T, cada
célula B o T debería expresar receptores antigénicos de singular especificidad
contra determinado antígeno. Quiere decir que el Sistema Inmune Adaptativo
(SIA) debería contar con mecanismos de exclusión alélica, para evitar que en la
superficie de una determinada célula B o T convivan simultáneamente receptores
de diversa especificidad.
La exclusión alélica es ejecutada a nivel del rearreglo y expresión de genes
codificantes de moléculas TCR o BCR (121,122,123,99).

Células B Memoria
(CD27+/IgG+ o IgA+)
Un 40% del compartimiento periférico de células B está constituido por células B
memoria y estas característicamente exhiben receptores B mutados, frecuentemente
IgG o IgA, CD 148 y CD27. La proteína de membrana CD27 es considerada desde
hace años un marcador específico de Células B memoria, pero veremos más abajo
que no parece ser absolutamente específico de ellas. El CD148 es un tirosin-fosfatasa
tipo receptor que puede encontrarse en un amplio rango de células B (124).
La Zona Marginal Esplénica es una región del bazo que alberga Células B
Memoria CD27+ de características biológicas muy parecidas a las que se encuentran
en regiones más superficiales de los folículos B de ganglios linfáticos, apéndices
inflamadas, amígdalas e íleon terminal. Las células B CD27+ humanas aisladas
de amigdalas se caracterizan por tener fenotipo “activado”, localización en
mucosa epitelial, expresión de exones V mutados y diferenciación preferencial a
células plasmáticas in vitro. A nivel de superficie expresan frecuentemente IgG o
IgA, pero esto no es excluyente dado que hay Células B Memoria que todavía no
completaron el cambio de clase de Inmunoglobulinas. Para completar su perfil es
necesaria la presencia de CD148 y particularmente CD27.
La superficie de los folículos en las mencionadas localizaciones consiste de una
capa interior de pequeñas células Naif IgD+/CD27-, cubierta por un área de células
más grandes CD27+/IgD+/-. Sin embargo las células CD27+ pueden también
ocupar toda la periferia alrededor del centro germinal. Es probable que la periferia
de los folículos represente un compartimiento de recirculación tanto para células B
Naif como para Células B Memoria o Reactivas Naturales (125,126,127).
La Zona Marginal Esplénica (ZME) es un compartimiento singular que contiene
células B con alta densidad de IgM y CR2 (CD21).
Entre las células de ZME hay un grupo heterogéneo que marca CD27+, expresa
IgM+sola, IgM+/IgD+ o IgD+sola, pero carece de función Memoria.
Dentro de la ZME hay un subgrupo de Células CD27+ que expresa IgM+/
IgD+, responde rápidamente a la estimulación antigénica sin intervención de células
T, experimenta Hipermutación Somática y produce Ab mutados (125,128).
Es interesante descubrir que, en determinadas circunstancias biológicas, el
fenómeno de Hipermutación Somática puede responder a una programación de
desarrollo totalmente independiente de la estimulación antigénica.
Este sería el caso de las células CD27+ IgM+ IgD+. Se trata de una subpoblación
de Linfocitos B que puede desarrollar y mutar su BCR fuera de los centros
germinales, sin requerimiento de interacciones con Células T.
Se sabe que las respuestas independientes de Células T no generan memoria ni
maduración de afinidad y brindan protección durante pocos meses (129).
Las células B CD27+ IgM+ IgD+ parecen constituir una línea de defensa
inmediata que carece de función Memoria. La mayor parte de los anticuerpos naturales
mutados, presentes en el suero humano, serían producto de estas células.
En definitiva podríamos afirmar que existen dos tipos de células portadoras de
CD27: las Células B Memoria, dependientes de Células T y las Células B IgM+/
IgD+ de ZME independientes de célula T, carentes de memoria (129).

Células B1
(CD5+)
El hábitat natural de estas células se encuentra en cavidades serosas como peritoneo o
pleura. Los Linfocitos B1 se originan durante la vida fetal a partir de células madres
de la médula ósea y tienen diferentes propiedades respecto de las células B2 clásicas.
Las células B1 expresan CD5 en la membrana y pueden dividirse en periferia
(son autorenovables). Las células B2 solamente pueden dividirse en respuesta a la
estimulación antigénica, dando lugar a células B memoria y células plasmáticas.
El BCR de las células B1 alcanza un menor nivel de diversidad que el BCR
de las células B2: solamente utiliza algunos segmentos V, no puede agregar
N nucleótidos en las uniones V(D)J y tiene reactividad contra muchos de los
antígenos carbohidrato.
Las células B1 segregan preferentemente IgM y experimentan escasa Hipermutación
Somática. Pueden responder a antígenos comunes a múltiples agentes
patógenos pero desarrollan uniones de baja afinidad.
Por eso se dice que tanto las células B1 como sus anticuerpos IgM son polireactivos.
Gran parte de la IgM en el ratón no inmunizado es producida por células B1. Por otra
parte las células B1 que se producen luego del nacimiento exhiben mayor grado de
diversidad que aquellas generadas en vida fetal, pero no tanto como las células B2.
Los Linfocitos B1 producen anticuerpos específicos contra ADN, inmunoglobulinas
(factor reumatoideo), antígenos carbohidrato y fosfatidilcolina. Por otra
parte dichos antígenos pueden activar la producción de células B1 (130).
No quedan claros cuales son los estímulos que promueven la diferenciación
hacia estirpe B1, pero algunas evidencias experimentales responsabilizarían de esto
al incremento en la señalización emitida desde BCR. De hecho la desfuncionalización
de genes activadores de la señalización BCR provoca decremento en la
producción de células B1 (131,132).
Sucede lo contrario cuando se alteran genes que intervienen en la regulación
negativa del BCR, como ocurre con el CD22 y la fosfatasa SHP-1 (133,134).

El Receptor de la Célula B (BCR) y sus co-receptores
El BCR es una inmunoglobulina en versión no soluble, anclada a la membrana
mediante su región hidrofóbica TM. La estructura básica del BCR y de las Inmunoglobulinas
es muy parecida. (Ver Inmunoglobulinas)
En el terminal carboxilo del BCR se distingue un espaciador, una región Trans
Membrana (TM) y una corta región intracitoplasmática. La región citoplasmática
de IgM e IgD es de tres aminoácidos de largo y se extiende a 14 y 28 AA en el caso
de la IgA e IgG (135).
Los terminales extracelulares amino alojan la región de interacción con el Ag (ab).
Es precisamente la región variable de esta región la que determina la especificidad de
reacción con el Ag y sirve de marcador específico para todo el clon (idiotipo).
Ya hemos mencionado que la Fracción Cristalizable (FC) o constante es la que
determina el destino funcional de la Inmunoglobulina, es decir su “Isotipo”. Un
BCR puede armarse con cualquier isotipo, pero en general siempre habrá un solo
isotipo por célula en cada momento específico de su evolución.
La Célula B Madura Naif constituye una excepción, tal como se describe más
arriba, dado que es portadora de dos isotipos diferentes (IgM+/IgD+).
Los otros tres isotipos (IgG, IgA e IgE) no pueden coexistir en un mismo tiempo
evolutivo de la Célula B. Ya hemos abundado sobre los mecanismos que conducen a
la enorme diversidad de las regiones Variables de los BCR y las Inmunoglobulinas.
Las proyecciones citoplasmáticas del BCR son demasiado cortas para sostener
los ensambles de proteínas de señales que convoca el encuentro antigénico.
Por eso el BCR integra un complejo más amplio apoyado en los heterodímeros
Igα(CD79a) / Igβ(CD79b).
Estas proteínas cuentan con sólo un dominio de inmunoglobulinas en la proyección
extracitoplasmática y un extenso dominio intracelular portador de unas
secuencias de AA ricas en residuos tirosina, llamadas ITAMs. Los ITAMs refieren
a la sigla en inglés Motivos Inmunoreceptores de Activación basados en Tirosina.
Se trata de secuencias de AA formadas por dos arreglos YXXL separados entre si
por 6 a 8 X, donde X significa cualquier AA, Y representa Tirosina y L Lisina. El
encuentro antigénico provoca cambios conformacionales inductores de fosforilación
sobre las Tirosinas (Y) de estas secuencias ITAM y esto se traduce en señales
de activación intracelulares (22,23).
Las fosfotirosinas de los ITAMs permiten el acople al complejo BCR de diversas
proteínas de señales y la conformación de ensambles llamados signalosomas.
También existen variantes inhibitorias llamadas ITIM, en los dominios intracitoplasmáticos
de proteínas moduladoras del complejo BCR como CD22 y FcγRIIB1.
Respecto de las señalizaciones intracelulares referimos al capítulo específico.

Complejo Co-Receptor CD19/CD21/Leu13/TAPA
La asociación entre el BCR y su Ag específico es muy fuerte e irreversible. Esto
provoca la internalización, degradación lisosomal y presentación de partículas antigénicas
en moléculas de MHC-II. Pero las señales que emite el receptor B desde
sus co-receptores Igα/Igβ son insuficientes para la activación de tales movimientos
y requieren de un sistema de amplificación. Dicho sistema está a cargo del complejo CD19/CD21/Leu13/TAPA (136).

CR2 (CD21)
El CD21 es un receptor de C3d, C3dg e iC3b que describimos en el capítulo de
Complemento. El CD21 captura partículas antigénicas cubiertas por C3dg y facilita
al BCR su aproximación al antígeno. En este contexto se produce la activación
simultánea de BCR y CD21 y las señales del BCR son amplificadas hasta mil veces
por el ensamble CR1CD19CD81Leu13 (137).

CD19
El CD 19 es una proteína que se encuentra en todas las Células de linaje B a partir
del estadío Pro-B tardío. Se trata de una glicoproteína de membrana que tiene un
dominio intracelular de 240 AA portador de nueve residuos tirosina.
La captura de complejos Ag-C3d por el CD21 facilita al BCR su acceso al
antígeno y arrastra al CD19 hacia el BCR activado facilitando la fosforilación de
sus tirosinas. Las nueve fosfotirosinas del CD19 sirven de anclaje a Kinasas y/o
adaptadores que multiplican las señales emitidas por el BCR (137, 138).

TAPA y Leu13
Estas son proteínas adhesivas y como tales intervienen en interacciones célulacélula que también contribuyen a las tareas amplificatorias del complejo CD19/CD21/Leu13/TAPA.
TAPA es la sigla resultante de Target of Antiproliferative Antibody 1 y es una proteína de 26 kDa también conocida como CD81.
TAPA es miembro de una familia de proteínas que exhiben cuatro dominios hidrofóbicos
o sea cuatro pasos de membrana. Estas glucoproteínas intervienen en señalizaciones
relacionadas con regulación del desarrollo, activación, crecimiento y motilidad (139,140).

Fosfatasa CD45
Ya hemos hecho referencia a esta proteína altamente glicosilada, que representa
hasta un 10% del total de las glicoproteínas de membrana. Mediante splicing alternativo
pueden surgir versiones con tres o cuatro exones menos (forma hipoglicosilada)
o más (forma hiperglicosilada).
Los linfocitos B suelen tener la forma hiperglucosilada y por consiguiente
muy activa. El CD tiene por misión desfosforilar una tirosina carboxiterminal
que bloquea el sitio Kinasa de enzimas src y de esta manera activa dichas enzimas.
Más arriba mencionamos que la activación del receptor B produce su
movilización a rafts y que el CD45 queda fuera de ellos, alejado del BCR: de
esta manera es modulada la reactividad del BCR. Cuando el CD45 tiene acceso
al complejo las Kinasas src son activadas y cuando queda afuera son desactivadas.
Si esto no ocurriera la activación del BCR no pararía y podría generarse
una neoplasia linfoide o un fenómeno autoinmune. De hecho hay pacientes con
esclerosis múltiple que tienen fallas en el splicing del CD45 y por otra parte las
Células B de los animales knock out para CD45 no responden con proliferación
cuando encuentran su Ag (141-143).

CD22
El CD22 es una glicoproteína de membrana con función lectina que se une al ácido siálico.
Despliega siete dominios de familia Inmunoglobulina en su proyección extracitoplasmática
y tres ITIMs en su proyección intracelular. El CD22 ejerce regulación negativa cuando el BCR está en reposo y positiva cuando el BCR está activado (144).
Es muy probable que el CD22 se vincule transitoriamente al BCR durante la
reacción inmune, contribuyendo a ligar ciertas proteínas a sus fosfotirosinas, con el
propósito de modificar ciertos componentes del receptor. Una de estas proteínas es
la fosfatasa de fosfotirosinas que tiene dominios SH2: PTP1C (SHP-1) (145).
Mientras la célula B permanece en reposo la fosfatasa PTP1C (SHP-1) se
encuentra físicamente asociada BCR y de esta manera preserva la desfosforilación
de los ITAMs en los heterodímeros Igα/Igβ.
El encuentro antigénico activa al BCR e induce la fosforilación de ITAMs en
los heterodímeros Igα/Igβ e ITIMs del CD22. En estas condiciones la fosfatasa
PTP1C(SHP-1) es atrapada por las fosfotirosinas del CD22 y alejada del BCR.
Sin embargo aún queda cerca del BCR, en condiciones de ejercer efectos modulatorios
sobre los ITAMs del complejo BCR.
Pero los dominios extracelulares del CD22 tienen gran afinidad por el Acido
Siálico y este suele expresarse en la membrana de Células T y Estromales,
en el ámbito del encuentro antigénico (Folículos Linfoides). La interacción
con ácido siálico aparta al CD22 y la fosfatasa SHP-1 lejos del complejo BCR.
En estas condiciones los ITAMs del hetrodímero Igα/Igβ quedan totalmente
liberados de su efecto inhibitorio (146).
Los ratones transgénicos CD22 -/- desarrollan células B de mayor madurez
que no recirculan por Médula Osea y generan subtipos B1 y B2 de distribución
normal. Cuando el BCR de las células CD22-/- es activado, se registra un flujo de
iones de calcio anormalmente elevado y mayor tendencia a la apoptosis. Por otra
parte, las células B CD22-/- exhiben mayor respuesta proliferativa a lipopolisacáridos
y defectuosa respuesta inmune independiente de Célula T.
Puede decirse entonces que la ausencia de expresión de CD22 reduce el umbral
de activación del BCR generando un estado de hiper-respuesta.
En este modelo, la estimulación del BCR sin el auxilio de células T CD4+
conduce a la apoptosis (36). Las células B deficientes en CD22 exhiben incremento
en el flujo de calcio intracelular y fenotipo de superficie típico de activación
crónica. Algo similar ocurre en animales deficientes en fosfatasa SHP-1 (147).
En definitiva puede decirse que el CD22 preserva al BCR de su activación espontánea,
cuando la célula está en reposo y facilita su activación, liberando el freno ejercido
por la fosfatasa SHP-1, cuando se produce el encuentro antigénico (147, 144,148).

FcγRIIB1
Este tipo de receptores tiene gran afinidad por la Fracción Cristalizable (FC) de
las Inmunoglobulinas (Igs). En Células B predomina el FcγRIIB1. Este tiene una
proyección citoplasmática caracterizada por la presencia de motivos ITIM, que
son secuencias de 13 AA con un residuo Tirosina. La fosforilación de los ITIMs
liga las fosfatasas SHP-1 y SHIP-1 al dominio intracelular del FcγRIIB1. Estas
fosfatasas des-fosforilan a los ITAMs de los heterodímeros Igα/Igβ y frenan de
esta manera la activación del BCR (149).
Los receptores Fc fueron descubiertos cuando se estudiaron las funciones de la
fracciones ab y Fc de los anticuerpos. Las Igs pueden separarse en dichas fracciones
mediante rotura de la región bisagra (hinge) por efecto de la papaína. La Proliferación
de Células B era estimulada con Fracción ab e inhibida con Fracción Fc de
Ab anti-Igs. Con esto quedó claro que estas células expresaban un receptor que
reconocía de manera específica a la fracción Fc de las Igs (150).
Era evidente que las Células B debían contar con mecanismos que permitieran
modular la respuesta inmune. Cuando las Células B capturan complejos Ag-Ab los
receptores Fc y BCR son coligados y los ITIM del FcγRIIB1 inhiben las señalizaciones
emitidas por el BCR.
De todo lo anterior queda claro que el BCR es una unidad funcional rigurosamente
controlada por sistemas de activación como el complejo CD19/CD21/
Leu13/TAPA e inhibición como el FcγRIIB1 (151,152).

Células Dendríticas Foliculares
Las Células B encuentran a su Ag en los Folículos Linfoides, fijado a la membrana
de Células Dendríticas Foliculares (CDF). Las CDF son células estromales exclusivas
de Folículos Linfoides primarios y secundarios. Su habilidad para retener Ag
por períodos prolongados fue demostrada mediante microscopía electrónica hace
ya 30 años. Desde entonces se logró su aislamiento, el desarrollo de anticuerpos
monoclonales específicos anti-CDF y la generación de líneas de CDF-like (153).
Es aquí donde las células B son sometidas a Hipermutación Somática, Cambio
de Clase de Cadenas Pesadas y diferenciación a Células Plasmáticas de Alta
Afinidad o Células B Memoria. Las CDF expresan los tres tipos de receptores de
complemento y también receptores para la región Fc de Igs. Es precisamente mediante
estos receptores que las CDF pueden atrapar y retener Ag bajo la forma de
complejos Ag/Anticuerpo/C3b. Es importante remarcar la diferencia con las Células
Dendríticas Interdigitantes (CDI): estas son llamadas simplemente “Dendríticas”,
son ubicuas y cuando atrapan Ag lo internalizan, lo fragmentan y lo cargan
en moléculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad tipo II (MHCII). Las
CDI presentan fragmentos de Ag a Células T en MCHII, mientras que las CDF
presentan Ag entero, no fragmentado a Células B. Las CDF No internalizan Ag y
las CDI Si internalizan Ag. Las CDF contribuyen de manera directa a la sobrevida
y activación de Células B Periféricas. La adhesión entre Células B y CDF resulta
de interacciones ICAM-1(CD54)/LFA-1(CD11a) y VCAM-VLA-4 (153,154).

Centros Germinales
Los procesos de Expansión Clonal, Cambio de Clase de Inmunoglobulinas (CSR),
Hipermutación Somática (SHM) y Maduración de la Afinidad tienen lugar en el
microambiente de los Centros Germinales (CG).
Estos fenómenos, particularmente SHM y CSR, dependen de la integridad funcional
de la citidin-Deaminasa-Inducible por Activación (AID) una enzima que expresa
específicamente en Centros Germinales (GCs). Aparentemente la AID tiene función
editora sobre el RNA y coopera con otra proteína para realizar sus tareas (155).
Los GCs se desarrollan en ganglios, bazo, amígdalas, placas de Peyer e Ileon
terminal y son de vida efímera: surgen en la primer semana de la respuesta inmune
y duran entre tres y cinco semanas (156, 157).
En los GCs primarios hay Células B IgM+IgD+ y Células Dendríticas Foliculares
(CDF). En los Folículos Secundarios se describe una Zona del Manto con
Células B IgM+/IgD+ y un CG compuesto de Centroblastos, Centrocitos, Células
T CD4+ activadas y CDF (38,39). En el Bazo se agrega una tercer zona, llamada
Zona Marginal Esplénica (ZME) que contiene un subgrupo de Células B caracterizadas
por CD27+/IgM+IgD+ o IgG+sola o IgD+ sola. Esta sería una línea
de defensa primaria que es independiente de Células T. En la ZME hay también
Macrófagos comunes y metalofílicos marginales (158).
Durante la respuesta inmune primaria se producen anticuerpos de baja afinidad
de subclase IgM. Posteriormente, la persistencia del estímulo antigénico vía
BCR y las interacciones vía CD40 promueven el ingreso de las células B Naif al
micorambiente del Centro Germinal (GC). En dicho espacio (GC) son sometidas
a expansión clonal (159).
En el GC son introducidos numerosos cambios de bases singulares en los exones
Variables, codificantes de sitios ligantes de antígeno: a este proceso se le llama Hipermutación
Somática. Esto es lo que permite diversificar aún más el repertorio inmune.
Simultáneamente tiene lugar en los GCs el proceso de Cambio de Clase de
mIgs, mediante el cual pueden producirse diversas clases de mIgs y anticuerpos:
IgG, IgA, IgM. Ambos procesos ocurren en el estadío centroblasto de maduración
B y permiten la generación de anticuerpos de alta afinidad.
Dichos centroblastos se diferencian ahora en Plasmocitos productores de anticuerpos
o células B Memoria.
Los Linfocitos B que producen anticuerpos autoreactivos o mIgs no funcionales
son eliminados de inmediato mediante apoptosis vía CD95/Fas (160, 161).
La inmunización primaria genera en el Bazo focos de Células B, Antígeno Específicas,
en áreas adyacentes a las capas Peri Arteriolares de Linfocitos (PALS).
Estas Células B producen IgG o IgM no mutada y eventualmente van a la apoptosis
y desaparecen o colonizan en Folículos Primarios constituyendo un segundo foco de
activación y diferenciación. De hecho parece existir relación clonal entre las Células
B de los PALS y de los CG. Por otra parte se especula que las Células Estromales
desempeñarían en los PALS un rol parecido al de las CDF(s) en los CG (162).
La producción de anticuerpos de alta afinidad depende de la generación de Células
B Memoria y esto depende de reacciones que ocurren dentro de los CG (163-165).
El contacto con el Ag y las Células T Helper (Th2) transforma las Células B IgD+/
CD38low (Naif) en Células Fundadoras (CF) de CG (CD38+/IgDhigh) (166,167).
En los CG se reconoce una Zona Oscura de intensa proliferación celular y una
Zona Clara rica en CDF. La Zona Oscura resulta de la proliferación de CF y su
cambio a morfología de Centroblastos. Las CF son activadas fuera de los CG y se
dividen dentro de la Zona Oscura en tiempos de duplicación de 6-7 horas. Luego
estas células migran a la Zona Clara adyacente, adquieren aspecto de Centrocitos y
son seleccionadas para sobrevivir en función de su afinidad por el Ag (163, 168).
Las Células B transitan el CG en una sola dirección: de Zona Oscura a Zona
Clara. Proliferan y mutan sus BCR(s) en Zona Oscura, pasan a Zona Clara para
probar su afinidad por el Ag y migran a la periferia o retornan a Zona Oscura para
mutaciones y proliferaciones clonales ulteriores (163,169).
Acorde con este modelo la Maduración de la Afinidad surgiría en el curso
de sucesivos pases de una a otra zona, con ciclos de replicación en Zona Oscura y
ciclos de selección en Zona Clara.
Los factores que permiten organizar el Centro Germinal en Zonas Oscura
y Clara no han sido dilucidados por completo, pero algunos receptores de quimiokinas
y sus ligantes parecen desempeñar un rol preponderante. Los animales
deficientes en receptor de quimiokina CXCR4 carecen de CG organizados. Los
Centroblastos expresan alta concentración de CXCR4 y migran hacia el ligante
CXCL12 que es muy abundante en el estroma de la Zona Oscura. El CXCL12
es también conocido como Stromal Derived Factor-1. Por otra parte el CXCR5
orienta a las células B hacia la Zona Clara y la ausencia de su ligante CXCL13
genera una Zona Clara aberrante (163,168).
El desarrollo normal del bazo, nódulos linfáticos y otros tejidos linfoides depende
de la integridad de las CDF. Las CDF son imprescindibles para la formación
y maduración de los CG.
Los complejos Ag/Ab/C3b son atrapados por los receptores CR1, CR2 y
FcγRII de las CDF y quedan expuestos en su membrana por períodos prolongados.
Las CDF proveen además de una variedad de moléculas co-esimulatorias (170).
Las Células B Naif toman contacto con el Ag cuando atraviesan la red de
CDF. Una vez producido el encuentro antigénico el complejo BCR-Ag es internalizado
y digerido en los lisosomas. Los fragmentos del Ag son luego cargados en
el surco presentador de las moléculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad
tipo II (MHC-II) y presentadas a las Células T Helpers (CD4+). Las Células
T Memoria de los CG reconocen las partículas antigénicas presentadas por las
células B, liberan IL-4/IL-5 e inducen en ellas el Cambio de Clase de Ig(s) y su
maduración a Células Plasmáticas o B Memoria (171).
Los animales transgénicos inmunizados, deficientes en Linfotoxina alfa (LTα),
Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNFα) o Receptor 1 del TNFα (TNFR1), carecen
de CDF(s) y CG(s) (162, 172, 173, 174).
Las citokinas TNFα y LTα pueden unirse a los mismos receptores (TNFR1
o TNFR2) y el trímero LTα/LTβ a un tercer tipo de receptor llamado LTβR. Los
animales que padecen déficit en LTα manifiestan carencia total de ganglios linfáticos
y placas de Peyer, severa reducción de la pulpa blanca en bazo y compartimientos B
y T mal definidos. Los animales deficientes en TNFα (-/-) y TNFR1 (-/-) exhiben
agenesia de CDF(S) y CG(s) tanto en Bazo como en Nódulos Linfáticos y localización
anormal de Células Plasmáticas en Bazo (en PALS) (162, 172).
El transplante con Células Tronculares de Médula Osea, proveniente de
animales normales, no permite recuperar el desarrollo de CDF en animales
TNFR1 -/-. Esto se debe a que dichos receptores No se expresan en Células
Hematopoyéticas.

Resumiendo el rol de las citokinas:
1- Las señalizaciones desde el TNFR1 dirigen el tráfico de Células B en los tejidos
linfoides secundarios.
2- Los Ligantes LTα y TNFα son imprescindibles para el desarrollo de estructura
esplénica normal, CDF y CG(s).

Autoinmunidad y Células B
La reactividad de células B contra moléculas propias se encuntra rigurosamente
vigilada, tanto a nivel central (Médula) como a nivel de estructuras linfoides secundarias.
En tejidos periféricos las portadoras de BCRs autoreactivos son sometidas a
apoptosis, edición o anergia (175).
De esta manera es possible mantener la producción de células B habilitadas para
el desarrollo de anticuerpos efectores de gran afinidad contra patrones moleculares
asociados a patógenos (PAMPs) y fuerte tolerancia hacia moléculas propias.
Pero dicha tolerancia resulta en gran medida de un sofisticado balance entre
señales inhibidoras y activadoras de la respuesta B y dicho balance puede romperse
dando lugar a fenómenos autoreactivos.
La desregulación de genes involucrados en apoptosis puede dar lugar al desarrollo
de fenómenos autoinmunes. Por ejemplo, la sobre-expresión de Bcl-2 en
ratones puede prolongar la sobrevida de clones autoreactivos que normalmente
desaparecen selección negativa dependiente de apoptosis.
Los animals transgénicos con mutación Bcl-2 desarrollan anticuerpos antinúcleo,
depósitos de complejos inmunes y glomerulonefritis (176).
Aún sutiles alteraciones en rutas de señalización pueden dar lugar a respuestas autoreactivas del BCR, con desarrollo de autoinmunidad y producción de anticuerpos autoreactivos.

Fas y FasL
Los pacientes con Síndrome Canale-Smith desarrollan linfadenopatías, hepatoesplenomegalia,
anemia hemolítica y trombocitopenia. En biopsia de ganglio exhiben
hiperplasia con incremento en células plasmáticas, linfocitos e histiocitos. El desarrollo
de hipergammaglobulinemia y anticuerpos antieritrocitarios sugiere que este
síndrome constituye una versión de enfermedad autoinmune. En al menos cuatro de
estos pacientes se registraron mutaciones en el “dominio muerte” (DD) del receptor
Fas (CD95). La estructura DD habita en la proyección citosólica de Fas y es crítica
para la transmisión de señales intracelulares activadoras de apoptosis. Una de las
tareas críticas de Fas consiste en activar la apoptosis de linfocitos y macrófagos activados,
contribuyendi a la modulación de la respuesta inmune (177-179).
También los animales con mutaciones en Fas (lpr) o FasL (gld) desarrollan
enfermedades autoinmunes similares al Lupus Eritematoso del humano. En estos
animales se encuentra gran cantidad de células T con débil expresión de CD4 y
CD8 en la superficie (células doble negativas) (180).
En humanos la mayoría de los casos de enfermedad autoinmune resulta de
una desregulación funcional de célula B, que responde a factores poligénicos y
ambientales propiciadores.
Dada la participación descollante de la célula B en la mayor parte de las enferemedades
autoinmunes del humano, el esfuerzo terapéutico tiende a concentrarse en dicha célula.

CD20
CD20 es una fosfoproteína no-glucosilada que se expresa característicamente en la
superficie de las Células B maduras. Interviene en el desarrollo y diferenciación de
células B a células plasmáticas. Todavía resta definir con precisión su rol específico
pero parece funcionar como canal de calcio. Esta molécula aparece en todos los
estadios de desarrollo de célula B salvo en progenitores iniciales y células plasmáticas.
El anticuerpo FMC7 reconocería una variante conformacional de CD20.
Esta molécula es el blanco terapéutico del Rituximab, un anticuerpo monoclonal
de gran importancia para el tratamiento de Linfoma No Hodgkin B, enfermedades
autoinmunes de familia lúpica y artritis reumatoidea (181-183).
Mediante el uso de anticuerpos anti-CD20 (Rituximab) es posible reducir la
cantidad de células B sin provocar mayor toxicidad sistémica. Con esta droga es
posible controlar formas severas de Artritis Reumaoidea, Lupus Sistémico, Sjogren
y muchas otras expresiones autoinmunes (184).
Otro sistema molecular involucrado en fenómenos autoinmunes es BAFFAPRIL
y sus receptores BAFF-R, TACI y BCMA.

BAFF-APRIL
BAFF significa B-Cell activating Factor y es también conocido como B Lymphocyte
Stimulator (Blas).
Es una glicoproteína transmembrana de 285 AA de longitud, forma parte de
la superfamilia TNFα y se expresa en Linfocitos B, monocitos, células dendríticas
y células estromales de MO (185,186).
Esta molécula puede desprenderse por clivaje de su región TM y adquirir forma
soluble. BAFF es ligante de tres receptores de familia TNFα conocidos como
BAFF-R, TACI y BCMA. Una proteína similar a BAFF es APRIL (A Proliferation
Inducing Ligand) que reconoce con mayor afinidad al receptor TACI (187).
BACI es un receptor que reacciona con igual afinidad con BAFF y APRIL.
Las señalizaciones a través de BAFF-R y BCMA inducen proliferación y antiapoptosis
en Linfocitos B. Como sucede con otros miembros de familia TNFα,
todos estos ligantes y receptores actúan bajo forma trimérica (188).
La identificación de BAFF constituyó un jalón importante para la comprensión
de los mecanismos involucrados en la sobrevida de las células B maduras.
BAFF tiene diversos roles en biología de Célula B que además de sobrevida incluyen
mantenimiento de centros germinales, cambio de clase de inmunoglobulinas y
regulación de diversos marcadores de superficie en Célula B (189,190).
El receptor BAFF-R desempeña un rol central en el sistema BAFF/APRIL
mientras que TACI despliega funciones de inhibidor. Dicho sistema ejerce tareas
tanto en el desarrollo, selección y homeostasis de las células B primarias como en
el mantenimiento de las Células Plasmáticas de larga vida.
La presencia de BAFF en altas concentraciones permite rescatar de la anergia
a las células B autoreactivas y esto podría desempeñar un rol crucial en inducción y
desarrollo de fenómenos autoinmunes (191).
De hecho, los animales trasngéncios que padecen sobre expresión de BAFF
exhiben incremento en la cantidad de células B en Bazo y Nódulos Linfáticos y
desarrollan fenómenos autoinmunes similares a pacientes con Lupus Eritematoso
Sistémico (LES) y Sindrome de Sjogren (SS).
Por otra parte la inhibición de BAFF con TACI-Ig y BAFFR-Ig permitió
neutralizar modelos murinos de Artritis Reumatoidea (AR) y LES.
En humanos se comprobaron niveles elevados de BAFF sérico tanto en
LES, SS como Esclerosis Sistémica (Scl). Por eso la desregulación del sistema
BAFF-BAFFR podría contribuir al desarrollo de enfermedades autoinmunes y
constituir un importante blanco terapéutico para el control de estos fenómenos
clínicos (192).
En los últimos años fue desarrollado un anticuerpo anti-BAFF/BLyS que reconoce
e inhibe la actividad biológica del mencionado ligante (Belimumab) (193).
Diversos fármacos bloqueadores del sistmema BAFF/BLyS se encuentran actualmente
en exprimentación básica y clínica.
Sobre Belimumab hay estudios en fases II y III sobre modelo clínico de Lupus
Eritematoso Sistémico.
También fue desarrollada la proteína de fusión Atacicept construída en base a la
proyección extracelular de TACI. Atacicept bloquea la activación de TACI por APRIL y
BAFF: actualmente se estudia en modelos clínicos de Mieloma Múltiple, LES y AR.
Pero quizás el producto que aventaja en experiencia es Rituximab, porque viene
usandose desde hace varios años y no provoca efectos indeseables demasiado importantes.
Los hematólogos tienen mucha experiencia con esta droga en Linfoma,
diversas citopenias inmunes e inhibidor de factor VIII. También hay varios estudios
clínicos en curso y su eficacia en AR ha sido probada en estudios en Fases II y III.

Deaminasa de Adenosina (ADA)
La enzima ADA desempeña una importante tarea en el metabolismo de las
purinas e interviene en el reciclaje del DNA en los tejidos. Como indica su nombre
“des” Amina la Adenosina para reconvertirla en Inosina. Luego la Inosina es convertida
en Hipoxantina mediante una Fosforilasa de Nucleósidos de Purinas.
Ciertas mutaciones en el gen ADA bloquean su expresión y provocan una versión
del sindrome congénito conocido como Inmunodeficiencia Severa Combinada.
Hay dos isoformas de ADA (1 y 2). La ADA1 se encuentra en la mayor parte
de las células del organismo, particularmente linfocitos y macrófagos. La ADA2
fue inicialmente identificada en tejido esplénico y posteriormente en otras células,
particularmente macrófagos, donde coexiste con ADA1.
Ambas versiones de ADA regulan la conversión de Adenosina a Desoxiadenosina
y potencian la capacidad parasiticida de los marófagos.
En plasma humano predomina ADA2, que se encuentra aumentada en artritis
reumatoidea, Lupus Eriematoso Sistémico, Sarcoidosis e infección por Mycobacterium
Tuberculosis (194).
ADA aumenta significativamente en Derrame Pleural de pacientes con Tuberculosis. Obviamente la ADA es producida por Macrófagos, Monocitos y Linfocitos como reacción a la invasión por Mycobacteria y no por el gérmen mismo (195,196).







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*capitulo extraído del libro: El Sistema Inmune: Genética, Biología Molecular, Clínica, Farmacología / Autores: Ricardo Antonio Giuliani y Eleno Martínez Aquino - 1a. Ed. - Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.
Eritroferon S.R.L., 2011.
ISBN 978-987-27121-0-5